LABORATORIO DE URGENCIAS

DEBATE: Biopsia Líquida - Promesas y Complejidades

• Keyur P. Patel, MD, PhD (medical director of the molecular diagnostics laboratory, Division of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center)
• Shashikant Kulkarni, PhD (deputy division head and professor of molecular pathology and cytogenetics, Division of Pathology and Laboratory Medicine, MD Anderson)
• Mark Linder, PhD (professor of pathology and laboratory medicine, University of Louisville School of Medicine)

CAP Today; March 2025

Como un Adán inspirado en el Jardín del Edén, los expertos moleculares han estado ocupados con el proceso de nomenclatura aplicado a la biopsia líquida.
Se ha perdido en el olvido si Adán revisó su nomenclatura, pero los patólogos y otros expertos están ansiosos por identificar nuevos ensayos a medida que impulsan este campo, desde el ADN circulante de células libres hasta el ADN tumoral circulante y el ARN tumoral circulante.
* Dr. K.P. Patel: Pronto, otro ensayo, que combina ctADN y ctARN, también podría empezar a dejar huella.
Él y sus colegas planean lanzar un ensayo para buscar ácido nucleico total circulante. ADN más ARN es igual a TNA: esa es la ecuación matemática.
* Dr. S. Kulkarni: Al igual que aquel primer cuidador del zoológico, incluso hay una bestia real que los expertos deben nombrar. Por supuesto, el mayor problema es el reembolso por todo esto. Los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid cubren algunas pruebas de biopsia líquida para algunos tipos de tumores cancerosos avanzados, pero no para todos, y la cobertura de los seguros privados varía significativamente. Es muy complejo. Y el panorama evoluciona a diario.
Lo mismo puede decirse de los posibles usos de la biopsia líquida. Junto con estos desarrollos, surgen aplicaciones, ya que los investigadores buscan extender los estudios iniciales a la práctica clínica. Los estudios ya han demostrado su capacidad para clasificar a los pacientes en categorías de riesgo y seleccionar el tratamiento. El seguimiento de la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento también parece prometedor, aunque aún necesitamos más información para compararla con la viabilidad de estos clones emergentes.
La amplia capacidad de la biopsia líquida, con sus grandes ambiciones y grandes interrogantes, presenta innumerables sutilezas. Esta es una prueba compleja que conlleva muchos matices.
Aunque existen tantas incógnitas, la biopsia líquida se ha convertido en una prueba de referencia en muchas situaciones. En MD Anderson, es valiosa cuando la muestra diagnóstica principal del paciente se agota o no está disponible y el oncólogo requiere un seguimiento adicional. Además, existen casos en los que el paciente tiene un tumor metastásico y no está claro qué tejido debe biopsiarse.
También es valiosa porque, gracias a sus tiempos de respuesta más rápidos, puede permitir un tratamiento más temprano.
De hecho, la biopsia líquida es crucial, y los estudios han demostrado una fuerte concordancia entre las pruebas de tejido y la biopsia líquida. Por supuesto, existen muchas salvedades al respecto.
El tejido sigue siendo el estándar de oro, la biopsia líquida se utiliza como complemento cuando no se dispone de tejido o existe una necesidad urgente. Incluso si se encuentra un marcador procesable,
El oncólogo generalmente prefiere obtener también una lectura basal del tejido.

PREGUNTA: El término biopsia líquida tiene diferentes significados para cada persona, aunque en esencia se refiere al análisis del material del tejido tumoral tradicional en sangre periférica.
* Dr. S. Kulkarni: También se están analizando otras muestras, como la biopsia líquida de orina, el líquido pleural o ascítico y la saliva. Los investigadores también están explorando el uso del líquido cefalorraquídeo.
* Dr. K.P. Patel: El ADN circulante ofreció el primer punto de apoyo y sigue siendo el método principal para muchos laboratorios que ofrecen esta prueba. Los estudios sobre ADN superan a los de ARN, en parte porque el ADN se considera el más estable de los dos. Por lo tanto, sabemos más sobre el ADN que sobre el ARN circulante, y este se ha convertido en el objetivo más común para diferentes aplicaciones de la biopsia líquida.
Los cambios a nivel de ADN incluyen mutaciones puntuales o pequeñas inserciones o deleciones. Otros cambios primarios a nivel del ADN incluyen reordenamientos genéticos, en los que dos genes diferentes, provenientes de distintas porciones del mismo cromosoma o de cromosomas completamente diferentes, forman una fusión quimérica que conduce a la oncogénesis.
Estos cambios se transmiten al ARN. Por lo tanto, se puede buscar la translocación a cualquier nivel, aunque a veces es más fácil identificar el cambio a nivel del ARN. Solo se busca una unión específica del ARN. Mientras que a nivel del ADN, esos puntos de ruptura pueden estar muy separados. Dado que los enfoques basados ​​en el ARN son desarrollos más recientes, los ensayos de biopsia líquida buscan principalmente fusiones a nivel del ADN. Sin embargo, a medida que la tecnología evolucione, debería ser más fácil mostrar las transcripciones de ARN y partes de ellas que circulan en la sangre.
* Dr. S. Kulkarni: Los enfoques convencionales actuales se centran principalmente en variantes y fusiones de un solo nucleótido, en escenarios limitados.
Si bien las fusiones surgen a nivel del ADN, la capacidad de detectar puntos de ruptura a nivel del ADN es limitada, ya que estos pueden abarcar una amplia región de intrones. A menudo no es posible ni práctico cubrir tanto territorio, por así decirlo. Pero cuando el ADN quimérico se transcribe a ARN, la situación se simplifica. Utiliza el ejemplo del exón 6 y el gen de fusión EML4::ALK, una de las fusiones que se observan comúnmente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El punto de ruptura se encuentra aguas abajo del exón 6 de EML4 y aguas arriba del exón 20 de ALK.
* Dr. K.P. Patel: Una vez que se producen los puntos de ruptura, la transcripción del ARN elimina las secuencias intrónicas, que son básicamente un exceso de secuencia, y quedan dos exones yuxtapuestos. Así, se sabe exactamente dónde están los puntos de ruptura: E6/A20.
Esto requiere mucha menos secuenciación como parte del diseño del ensayo. El enfoque a nivel de ADN no es práctico para todas las fusiones, dado que los laboratorios actualmente no cuentan con los recursos para una secuenciación ilimitada. Pero con el ARN, dependiendo de la tecnología utilizada, se pueden detectar muchas más fusiones, con un esfuerzo de secuenciación incluso menor en teoría. La tecnología basada en amplicones, por ejemplo, puede dirigirse a los dos exones de fusión con pequeñas sondas.
Estamos intentando desarrollar un enfoque que implique la extracción total de ácidos nucleicos (el mencionado cTNA). Lo dividimos en ADN y ARN. Hay muy poco material con el que trabajar (en cantidades del orden de nanogramos) y debemos aprovecharlo al máximo. Analizamos el ADN y el ARN por separado, pero a partir del mismo extracto común de TNA. De esta manera, podemos identificar ambos fragmentos de información simultáneamente.
* Dr. S. Kulkarni: En un futuro próximo, los enfoques basados ​​en la metilación podrían empezar a tener un impacto en este campo, lo que podría mejorar la precisión en la deducción de enfermedades residuales.

PREGUNTA: Las aplicaciones clínicas siguen creciendo rápidamente a medida que la tecnología se desarrolla, especialmente en tumores en estadio avanzado que pueden ser difíciles de biopsiar por métodos tradicionales.
* Dr. K.P. Patel: También hay indicaciones aprobadas por la FDA próximamente para otros tipos de tumores, donde la biopsia líquida será una investigación aceptable para identificar una mutación diana y dirigir la terapia. No es universal para todos los tipos de tumores, pero dependiendo de la evidencia, para ciertos tipos de tumores, como el carcinoma torácico de células no pequeñas, es una aplicación aceptable incluso para la selección directa del tratamiento.
Una ventaja obvia es que las investigaciones pueden avanzar más rápido que cuando se programa un procedimiento de biopsia invasiva, lo que acelera el tratamiento.
Un resultado negativo no descarta la presencia de una alteración; sin embargo, limita el valor de una biopsia líquida en ciertas situaciones. Si no se encuentran resultados informativos, no se puede concluir que no haya hallazgos informativos. En otras palabras, la necesidad de rapidez debe ir acompañada de una cuidadosa previsión. Tras la brillante promesa de la biopsia líquida se encuentran fundamentos biológicos que los investigadores aún están descifrando.
* Dr. S. Kulkarni: El aspecto más importante a tener en cuenta con respecto a las muestras es que cada tipo de tumor difiere en la cantidad de ácido nucleico que libera al torrente sanguíneo.
Esta es una variable bastante significativa. Los tumores con alta liberación de ADNc incluyen el cáncer de pulmón de células no pequeñas y los cánceres colorrectal, pancreático, de mama y de esófago. En el otro extremo del espectro se encuentran los tumores cerebrales, donde la barrera hematoencefálica limita la cantidad de ADNc. Otros tipos de cáncer, como los sarcomas, los tumores de tiroides y los tumores testiculares y de próstata, también presentan una baja liberación de ADNc. La liberación de ADNc depende principalmente del tipo de tumor, su tamaño (los tumores grandes liberan más ADN) y su vascularización. Además, los tumores metastásicos son más propensos a liberar más ADNc que los tumores localizados, al igual que los tumores más agresivos. Si bien preferimos ofrecer estas pruebas de forma pan-cáncer, debemos ser muy cuidadosos con los falsos negativos.
* Dr.K.P. Patel: Por el contrario, la hematopoyesis clonal de potencial indeterminado puede producir falsos positivos. "Aún estamos aprendiendo cosas a nivel de tumor individual", afirma el. "No podemos generalizar".
La mayoría de nuestras observaciones se concentran en un momento dado. Por lo tanto, tenemos correlaciones muy variables a medida que aumenta la carga tumoral". Si un paciente presenta múltiples metástasis o loci tumorales diferentes, la carga tumoral general es alta y aumenta la probabilidad de que algunos de ellos liberen ADN o ácido nucleico. Esto suele verse reflejado en la información de la biopsia líquida, en términos de la fracción de ADNct y de la frecuencia alélica variante de cualquier mutación identificada". Por esta razón, la mayoría de las aplicaciones clínicas se centran en tumores metastásicos avanzados.
Esencialmente, la biopsia líquida es un indicador informativo en estos casos.
En resumen, existen factores biológicos y clínicos definidos que determinarán la utilidad del ensayo. Por eso, si observamos una mutación en la circulación, siempre es útil. Pero si no la detectamos, no significa que algo no esté sucediendo.
Explicar los resultados de las pruebas, como era de esperar, conlleva sus propias complicaciones.
* Dr. S. Kulkarni: Los campos de los colegas oncólogos se centran en la concordancia, o la falta de ella, con los resultados de la biopsia de tejido. La concordancia entre la biopsia de tejido y la biopsia líquida también depende del tipo de tumor y del estadio del cáncer. Estudios han demostrado que las tasas de concordancia oscilan entre el 60 % y el 90 %. Es menor cuando el tumor no desprende suficiente ADN.
La heterogeneidad tumoral puede afectar los resultados, así como el momento de la toma de la muestra. La concordancia es mayor cuando se extrae el tejido y la biopsia al mismo tiempo. Incluso una diferencia de unas pocas semanas puede afectar el resultado, debido a la evolución del tumor y a los cambios inducidos por la terapia. La sensibilidad del método analítico (secuenciación de nueva generación, PCR digital o PCR digital de gotas) también afecta la concordancia.

PREGUNTA: Una vez tomada la decisión de utilizar la biopsia líquida, al menos como primer paso, entran en juego las variables preanalíticas.
* M. Linder: No es fácil trabajar con esta muestra. Las concentraciones son muy bajas y no se ha estandarizado mucho el manejo del plasma para la extracción.
Esto incluye el uso del tubo de recolección adecuado. Puede parecer obvio, especialmente porque la biopsia líquida se ha integrado en la práctica clínica en los últimos años; además, las pruebas se concentran principalmente en centros médicos académicos con recursos y procesos bien establecidos, así como en laboratorios comerciales.
* Dr. K.P. Patel: Pero es un tema tan importante que cualquiera que esté empezando a hacerlo debe tener en cuenta que el tipo de tubos de recolección y las condiciones preanalíticas influirán en el resultado.
Dado que básicamente se trata de encontrar estas pocas moléculas flotantes en el plasma, la estabilidad de la muestra se convierte en un problema. Si las células sanguíneas no se estabilizan adecuadamente, pueden comenzar a morir y liberar su propio ADN y otro material genético en la muestra, mientras que una muestra bien conservada contendrá solo el ADN derivado del tumor. El objetivo es evitar el ruido generado por el ADN no tumoral. De lo contrario, resulta difícil identificar la señal real, que ya es baja. Los expertos revisaron minuciosamente 1228 publicaciones circulantes sobre ADN tumoral para desarrollar un conjunto de 13 recomendaciones de buenas prácticas.
Si los laboratorios no pueden recolectar muestras en tubos con material estabilizador, deberán realizar sus propios estudios y asegurarse de que las muestras se transporten en condiciones ideales que permitan que la mayor cantidad posible de plasma permanezca libre de material genómico adicional liberado por células no tumorales.
Las muestras también deben conservarse de manera oportuna. Mi grupo ha publicado estudios que comparan el uso de tubos con EDTA con los que utilizan material estabilizador. Para los laboratorios que envían muestras a un laboratorio externo para su análisis, la estabilidad de la muestra cobra una importancia crucial. Los factores preanalíticos siguen siendo críticos. Cualquiera que implemente esto por primera vez y configure su flujo de trabajo debe asegurarse de implementar las mejores prácticas.
* Dr. S. Kulkarni: Esas prácticas están lejos de estar consolidadas. Este es un tema complejo y en constante evolución. No existe suficiente estandarización.
* Dr. K.P. Patel: Estoy de acuerdo, y observo que la naturaleza patentada de gran parte del desarrollo de ensayos ha creado un obstáculo. Necesitamos desarrollar y mantener estándares escalables que puedan adaptarse a nuevas aplicaciones y analitos. Necesitamos aplicar un marco consistente, especialmente en el contexto de referencia.
Sin transparencia y estandarización, ciertos matices pueden perderse a medida que los ensayos se utilizan más ampliamente. Por ejemplo, un laboratorio puede decidir utilizar una entrada de 30 nanogramos; otro, una de 10 nanogramos. Dependiendo del método de extracción utilizado, la cantidad de material de partida disponible, el ensayo utilizado y el proceso bioinformático empleado, todo esto influye en el resultado final.
Además, el uso de la biopsia líquida en todo el espectro de la atención al paciente requiere que los ensayos tengan una cobertura suficiente para diferentes marcadores. Es necesario poder decir: "Hemos analizado todos los posibles marcadores disponibles" y, si se incluye un gen en particular, ¿qué regiones del gen se incluyen? ¿Qué tipo de cambios genéticos cubren los ensayos? Es importante definir todo esto. ¿Cuál es el ensayo mínimo aceptable para considerar que el paciente se ha sometido a una investigación justa y suficiente? De lo contrario, al ser tan fácil y conveniente, puede ser muy tentador repetirlo si los resultados no están estandarizados y no son definitivos. Creo que simplemente debemos ser cautelosos.
* Dr. S. Kulkarni: Esa necesidad persistirá durante algún tiempo. La utilidad clínica y la interpretación no son sencillas. Necesitamos más ensayos. Necesitamos más estudios controlados; se necesita una mayor recopilación de evidencia longitudinal. En resumen, el verdadero valor clínico de estas pruebas a largo plazo no se ha estudiado exhaustivamente. Aunque algunas se están convirtiendo en el estándar de atención, aún queda trabajo por hacer, especialmente en el ámbito de la enfermedad residual medible (ERM), donde utilizamos esa información para asesorar al paciente. Estas son preguntas difíciles de responder.
* Dr. K.P. Patel: He aquí otro momento de regreso al Edén. El uso de la biopsia líquida para evaluar la enfermedad residual y monitorear la respuesta al tratamiento aún no es una práctica común, aunque probablemente se convertirá en una práctica rutinaria. Pero no existe un acuerdo universal: "no hay sello de aprobación".
Solíamos llamarla enfermedad residual mínima, porque creíamos que era mínima con nuestros ensayos históricos, con sus niveles limitados de detección. Pero ahora el cambio es llamarla enfermedad residual medible para indicar que podemos medirla.
* Dr. S. Kulkarni: Sí, mínima es un término aceptado. Pero yo uso enfermedad residual molecular, porque soy un experto en molecular. Pero no soy el único. A quienes trabajan en este ámbito también les gusta usar ese término. Es la detección de enfermedad residual mínima mediante tecnologías moleculares, así que cambiamos de mínima a molecular. La aplicación de la ERM, bien establecida en neoplasias hematológicas, está adquiriendo especial importancia para los tumores sólidos. La mayor parte de este trabajo se encuentra en las etapas de ensayos clínicos, ya que los investigadores intentan determinar cómo los resultados de la biopsia líquida se ajustan a métodos más consolidados, como la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones (PET), para evaluar la respuesta tumoral. Nuevamente, la sensibilidad y la precisión del ensayo serán cruciales, ya que permitirán a los laboratorios identificar con precisión una señal de bajo nivel como... Real, no ruido.
Por otro lado, es importante recordar que antes de que el paciente desarrollara un tumor metastásico avanzado, este comenzó en algún punto. Este es otro punto en el que la carga tumoral es baja y hay menos material circulante. Ahí es donde, de nuevo, algunas características biológicas y el rendimiento del ensayo entran en conflicto.
Eso es lo que observamos en la práctica clínica. En pacientes con marcadores o alteraciones conocidos al inicio, podré monitorizar su presencia en la circulación y su correlación con la respuesta.
Si la biopsia líquida revela algunos fragmentos, pero no se ha detectado nada mediante PET o RMN, ¿es viable? Ese es el reto que la comunidad científica debe afrontar ahora. ¿Monitoreamos a esos pacientes más de cerca? ¿Modificamos su tratamiento? ¿Les instamos a un tratamiento?
* Dr. S. Kulkarni: En cuanto a la detección temprana de cáncer múltiple, la prueba está disponible para cualquier persona hoy en día. Pero tiene muchas limitaciones. Francamente, yo sería cauteloso. I would be wary of it,.

PREGUNTA: A estas alturas, debería estar claro que cada avance en este campo también desvela más incógnitas, incluso en el nivel más básico.
*M. Linder: Las preguntas fundamentales se refieren a la relación entre el ADNct y la carga tumoral. En un estudio reciente, él y sus colegas (Egger ME, et al. Transl Oncol. 2024;42:101883) comenzaron a analizar más a fondo la correlación entre ambos.
Los resultados de ese primer artículo fueron bastante reveladores. Seguíamos queriendo ver una correlación, y esperábamos verla, y no la vimos. Esto nos retó a preguntarnos: "¿Qué está sucediendo realmente aquí?". Los cambios en tiempo real en el ADNct plasmático se correlacionan con la respuesta terapéutica y la gravedad de la enfermedad, más que con el volumen tumoral absoluto.
Aunque muchos factores afectan la cantidad de ADNct, como se ha señalado, él y otros están explorando una línea de pensamiento actual que sugiere que el ADNct representa el grado de recambio tumoral, o actividad, más que la masa tumoral. En mi opinión, esto lo convierte en un biomarcador mucho más potente. Porque no se utiliza como un indicador indirecto asociativo de la carga tumoral, sino como una medida directa de la actividad biológica. Para mí, esto marca una gran diferencia, ya que la masa tumoral crece relativamente despacio con el tiempo, mientras que la proliferación tumoral puede detectarse muy temprano.
Ese marco conceptual podría ayudar a definir la utilidad clínica del ADNct como algo más potente que su uso como indicador indirecto para la imagenología u otras estrategias de vigilancia. Se trata de analizar en profundidad y observar qué sucede biológicamente.
Incluyo mi propio trabajo en el juego de la nomenclatura. A él le gustaría que se hablara más sobre la medición de la EMR, postulando que la enfermedad residual que no se regenera activamente no puede producir suficiente ADNct medible. Así que no se trata solo de enfermedad residual mínima, sino de enfermedad activa residual mínima", afirma.

PREGUNTA: El proceso dinámico de denominación se correlaciona con un campo dinámico. Y aunque Adán y Eva no tardaron mucho en salir del Edén, para los médicos que continúan adquiriendo nuevos conocimientos, este trabajo debería mantenerlos activos durante muchos años.
* Dr. S. Kulkarni: A pesar de todos los matices, preguntas, inquietudes y desafíos, soy optimista sobre el papel de la biopsia líquida en el diagnóstico, especialmente en aplicaciones pronósticas.
Los investigadores también están considerando el uso de la biopsia líquida en el contexto de la evaluación de la respuesta a los tratamientos con inhibidores de puntos de control. Los enfoques multiómicos están despertando interés, al igual que la integración de inteligencia artificial, que utiliza diferentes algoritmos para incorporar patología y radiología adicionales. Todo esto plantea "preguntas apasionantes".
* Dr. K.P. Patel: No hay pequeñas ambiciones en este campo. Así es como progresamos. De hecho, la primera biopsia líquida que realizamos en el MD Anderson, hace muchísimos años, fue para un paciente con metástasis y coagulabilidad como parte del cáncer. Así que el paciente no era un buen candidato para una biopsia, pero aun así pudimos extraerle un tubo de sangre y encontramos una alteración que permitía actuar. Y aunque no tomo las decisiones de tratamiento, las opciones para nuestros equipos clínicos habrían sido limitadas si no hubiéramos tenido esa biopsia líquida disponible para ese paciente.
* Dr. S. Kulkarni: la sensación de asombro que sintió al principio de su carrera. Recuerdo cuando recién aprendimos sobre las células tumorales circulantes. Y recuerdo que en mi antiguo laboratorio, en la Universidad de Washington, teníamos un equipo enorme para aislar las células tumorales circulantes, algo que nunca se generalizó.
Hemos avanzado mucho desde entonces —continúa—, y es asombroso ver toda esta evolución de las biopsias líquidas y su enorme potencial. Todo esto ha sido una sorpresa increíble y agradable. Pero aún queda mucho trabajo por hacer. Soy muy optimista respecto al crecimiento significativo de este campo.