LABORATORIO DE URGENCIAS

 
Intestino - Patrón Microbiano Regula la Alimentación

Winston W. Liu, Naama Reicher, Emily Alway, Laura E. Rupprecht, Peter Weng, Chloe Schaefgen, Marguerita E. Klein, Jorge Villalobos, Carlos Puerto-Hernandez,Yolanda Kiesling Altún, Amanda Carbajal, José Aguayo Guerrero, Alam Coss, Atharva Sahasrabudhe,M. Maya Kaelberer & Diego V.Bohórquez

Nature (2025), July -  https://doi.org/10.1007/springer_crossmark_policy, 

Cada organismo interpreta el mundo a través de sus sentidos.8,9. Si bien se han estudiado extensamente cinco sentidos canónicos, la evidencia emergente ha establecido la base neuronal del sentido intestinal, un sentido que evalúa en forma constante los estímulos que surgen del lumen intestinal1–5,10–12.
Los nutrientes, el estiramiento y los microorganismos se encuentran entre los estímulos más destacados que el intestino encuentra. En el intestino delgado, las células epiteliales de los neurópodos1,13–15 detectan rápidamente los nutrientes y transmiten la información sensorial, a través del nervio vago, para influir en las elecciones apetitivas del animal en tiempo real4,16–19.
Cada vez hay más evidencia que sugiere que los microorganismos intestinales, que son más abundantes en el colon20, modulan sustancialmente la conducta alimentaria 21–24, posiblemente a través de neuromoduladores25–27, señales inmunitarias28 y vías vagales 23,24,29–34.
Sin embargo, aún se desconoce un circuito neuronal directo a través del cual el huésped interpreta la información sensorial microbiana para ajustar su alimentación. En el colon, las neuronas vagales forman circuitos neuroepiteliales con células neurópodas, marcadas por el neuromodulador PYY1,3. Estas y células epiteliales  colónicas están constantemente expuestas a microorganismos, que pueden reconocerse mediante patrones moleculares como la flagelina, conocidos colectivamente como patrones moleculares asociados a microbios.
La flagelina es un componente estructural de uno de los tres orgánulos más antiguos, los flagelos 35, y una proteína conservada en el filo 6 bacteriano que activa el receptor de reconocimiento de patrones TLR5 (refs. 36,37).
La eliminación de Tlr5 en todas las células epiteliales intestinales de ratones provoca obesidad, inflamación metabólica y colitis espontánea28.
Además, la evidencia de líneas celulares intestinales inmortalizadas sugiere que los receptores tipo Toll podrían ser expresados por células epiteliales sensoriales especializadas, incluidas las que secretan la proteína inductora de saciedad PYY38. Determinamos que la conducta alimentaria está regulada por una modalidad sensorial intestino-cerebro para los patrones microbianos, previamente desconocida.
A este sentido, en la interfaz entre la biota y el cerebro, lo denominamos sentido neurobiótico.

Las células PYY expresan Tlr5.
En el intestino, las células epiteliales sensoriales se dispersan entre otras células epiteliales en una proporción inferior a 1 por 1000. 39. Abarcan dos linajes principales: los que expresan serotonina y sustancia P, y los que expresan TLR5 en las células marcadas con PYY del íleon y el colon. Para determinar la función de TLR5 en las células marcadas con PYY, criamos ratones Pyycre;Tlr5fl/fl. En estos ratones, Tlr5 está inactivado en todas las células marcadas con PYY. Estudios han demostrado que la supresión global de Tlr5 en ratones causa disfunción metabólica, inflamación y obesidad.
Además, cuando se suprime TLR5 en todas las células epiteliales intestinales, tanto la disfunción metabólica como la inflamación persisten. 28 Sin embargo, observamos que cuando se suprime TLR5 específicamente en células marcadas con PYY, los ratones no muestran evidencia de disfunción metabólica ni inflamación.
En comparación con los controles de camada, los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl presentaron una tolerancia oral a la glucosa, una glucemia en ayunas y un peso de la almohadilla grasa normales. Los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl tampoco mostraron cambios en los niveles séricos de los neuromoduladores metabólicos GLP-1 y PYY tras una hora de consumo de alimento, lo que sugiere que los niveles circulantes de hormonas intestinales no difirieron de los de los controles de camada. Además, estos ratones no mostraron signos de colitis espontánea y presentaron una longitud, un peso y un tamaño del bazo normales.
Los niveles de los marcadores inflamatorios mieloperoxidasa colónica y lipocalina-2 fecal se mantuvieron sin cambios entre los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl y los controles. Además, no se observaron diferencias histológicas en el colon, incluyendo la profundidad de las criptas y la densidad de células sensoriales. La expresión del gen TLR en las células epiteliales se mantuvo inalterada y no se observaron cambios en las uniones estrechas en los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl en comparación con los controles de la misma camada.
Cabe destacar que, cuando se elimina TLR5 específicamente en las células marcadas con PYY, los ratones comen más y ganan más peso.
Dado que se sabe que TLR5 desencadena respuestas inmunitarias mediante la activación intracelular del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88)47, cruzamos ratones Pyycre; Myd88fl/fl para determinar el efecto de la eliminación de MyD88 en las células marcadas con PYY. Observamos, en comparación con los ratones de la misma camada, los ratones Pyycre;Myd88fl/fl no mostraron un aumento de peso corporal ni de la ingesta de alimentos.
Por lo tanto, independientemente de la señalización inmunitaria canónica, la disfunción metabólica o la inflamación, el TLR5 en células marcadas con PYY regula la ganancia de peso corporal.
Además, realizamos un análisis de patrones de alimentación para determinar la cantidad, la frecuencia y el momento de la ingestión de alimentos. Optimizamos un sistema automatizado de comportamiento en jaulas que registra la ingesta de alimentos con una precisión de 0,01 g y una resolución temporal de 1 s. Tanto los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl machos como las hembras consumieron comidas significativamente más abundantes en comparación con los controles de camada (machos: n = 6-9 ratones; hembras: n = 8-9 ratones; P < 0,05). Además, las hembras de ratones Pyycre;Tlr5fl/fl también consumieron comidas más largas que los controles de camada, lo que revela que la duración y el tamaño de las comidas están modulados por TLR5 en las células marcadas con PYY.

Las células PYY utilizan TLR5 para detectar la flagelina.
El ligando establecido para TLR5 es la flagelina. Aunque los modelos transcripcionales sugieren que la dieta influye en las señales microbianas48, no está claro si la cantidad de flagelina colónica cambia con la alimentación. Mediante un ensayo celular, observamos que los niveles relativos de flagelina en las heces son significativamente mayores en los ratones alimentados que en los ratones en ayunas.
Esta respuesta no se altera en los ratones Pyycre;Tlr5fl/fl, lo que indica que los niveles de flagelina en el colon son independientes de Expresión de Tlr5 en células marcadas con PYY. Por lo tanto, la alimentación se correlaciona con un aumento de flagelina en el colon.
El análisis mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) confirmó la expresión de Tlr1-Tlr5 en células colónicas PYY-GFP; sin embargo, en comparación con los niveles de expresión en las células epiteliales vecinas, solo la expresión de Tlr5 mostró un enriquecimiento significativo en las células marcadas con PYY. Para determinar si estas células responden a ligandos para receptores tipo Toll, registramos la actividad de calcio intracelular de células colónicas marcadas con PYY. Criamos un ratón Pyycre; Salsa6f en el que las células marcadas con PYY expresan la proteína Salsa6F. Esta proteína de fusión, que une tdTomato y GCaMP6f, permite clasificar las células primarias según su fluorescencia roja y registrar calcio intracelular, evitando la toxicidad de los colorantes indicadores de calcio49. De todas las células Pyycre; Salsa6f observadas, ninguna respondió a la el 19% del lipopolisacárido del ligando TLR4 respondió al poli(I:C) del ligando TLR3 y el 26% respondió al flagelina del ligando TLR5. Las respuestas de calcio al poli(I:C) no se alteraron en presencia del inhibidor de TLR5 TH1020, las respuestas a flagelina se atenuaron significativamente, lo que demuestra que la activación de la flagelina en células marcadas con PYY requiere TLR5. Se confirmaron resultados similares utilizando ratones NeuroD1-Cre;Salsa6f.
Posteriormente, determinamos si la activación de células marcadas con PYY por ligandos TLR conduce a la liberación de PYY. Aunque el poli(I:C) (1 μg ml−1) no estimuló la liberación de PYY de las criptas colónicas disociadas en comparación con el tampón, la flagelina (100 ng ml−1) estimuló liberación significativa de PYY.
Esta liberación se suprimió significativamente en las criptas colónicas de ratones que carecían de TLR5 en células marcadas con PYY. Por lo tanto, las células marcadas con PYY detectan la flagelina mediante TLR5 y la transducen liberando PYY, un conocido inductor de saciedad. Las células PYY se conectan con neuronas vagales.
Además de las funciones circulatorias del PYY intestinal^50,51, trabajos recientes muestran la señalización paracrina y sináptica local hacia el nervio vago.52
Previamente, el rastreo monosináptico de la rabia había demostrado que las células marcadas con PYY en el colon forman conexiones sinápticas con neuronas vagales. Estas células, conocidas como células neuropodales, transducen de forma rápida y directa las señales sensoriales al sistema nervioso3,54.
En comparación con las células epiteliales vecinas, las células marcadas con PYY presentan un enriquecimiento significativo de genes que codifican proteínas implicadas en la señalización sináptica, la formación sináptica y la neurotransmisión. Además, aproximadamente una de cada cinco células marcadas con PYY contacta con neuronas periféricas marcadas con PGP9.5 en el íleon y el colon.
En ratones Pyycre;ChR2, un estímulo de luz de control de 532 nm aplicado al lumen del colon no activó el nervio vago cervical, pero un estímulo luminal de 473 nm provocó un aumento rápido y significativo de la frecuencia de activación vagal.
La activación vagal alcanzó su punto máximo a los pocos segundos del estímulo de luz de 473 nm, lo que demuestra que las células marcadas con PYY activan directamente el nervio vago. Estos resultados establecen un circuito directo entre células vagales marcadas con PYY para la señalización rápida entre el colon y el rombencéfalo, donde termina el nervio vago aferente55.

La flagelina se transduce a las neuronas vagales.
Se registró la actividad vagal cervical en respuesta a la perfusión colónica de flagelina. Intralipid sirvió como control positivo. La perfusión de flagelina (2 μg ml−1) a través del colon produjo un aumento significativo de la frecuencia de descarga vagal en cuestión de segundos. Para determinar si la célula marcada con PYY es necesaria para transducir la flagelina luminal al vago, se crió un ratón Pyycre;Halo. En estos ratones, las células marcadas con PYY expresan la proteína de silenciamiento optogenético halorrodopsina, un canal aniónico que hiperpolariza las células en respuesta a la luz de 532 nm. Un estímulo de luz de control de 473 nm aplicado al lumen del colon no alteró la actividad vagal en respuesta a la flagelina (2 μg ml−1), pero un estímulo luminal silenciador de 532 nm suprimió la activación vagal en respuesta a la flagelina.
Además, en ratones Pyycre;Tlr5fl/fl, la flagelina luminal no produjo una respuesta vagal rápida en comparación con los controles de la misma camada. Por lo tanto, las células de neurópodos marcadas con PYY utilizan TLR5 para detectar la flagelina luminal y transducir rápidamente este estímulo microbiano al nervio vago.
Los análisis moleculares que utilizan secuenciación de ARN, qRT–PCR e hibridación in situ muestran que las neuronas vagales no expresan Tlr5. Además, la obtención de imágenes de calcio de neuronas nodosas vagales disociadas de forma aguda reveló que mientras que la capsaicina (el estímulo de control) provoca cambios transitorios de calcio, la flagelina no lo hace, lo que indica que las neuronas nodosas vagales por sí mismas no detectan la flagelina, lo que establece aún más a las células de los neurópodos marcadas con PYY como transductores de flagelina.

Se requiere el receptor vagal NPY2.
Luego, buscamos determinar si la actividad vagal en respuesta a la flagelina requiere la liberación de PYY por parte de las células de los neurópodos. Datos publicados de secuenciación de ARN muestran que las neuronas vagales que inervan el colon expresan el receptor de PYY Y2R56. En el intestino, se cree que este receptor media la señalización local de PYY51.
Mediante hibridación in situ, confirmamos la expresión de Y2R en neuronas vagales sin dosis. Posteriormente, descubrimos que el bloqueo de Y2R con BIIE-0246 (10 μM) suprime la actividad vagal cervical en respuesta a la flagelina perfundida a través del lumen del colon.
Para comprender mejor cómo responden las neuronas vagales individuales a la flagelina en el intestino, utilizamos imágenes de calcio intravital para observar la actividad de estas neuronas en respuesta a los estímulos perfundidos a través del colon. Utilizamos un modelo murino triplemente transgénico, Snap25-FosTRAP-tdTomato57,58, que permite el seguimiento en tiempo real de los cambios de calcio en neuronas vagales individuales y el posterior marcaje de estas neuronas sensibles para su posterior análisis. Tras la obtención de imágenes, extrajimos los ganglios nodosos y, mediante análisis compartimental de la actividad temporal mediante hibridación in situ con fluorescencia59, confirmamos que el 43,37 % de las 332 neuronas marcadas con NPY2R reaccionaron a la flagelina en el colon.
Las imágenes de calcio de las neuronas nodosas vagales revelaron patrones de respuesta distintos: el 11,7 % de las neuronas respondió únicamente al intralípido (un control positivo), el 27,7 % respondió tanto al intralípido como a la flagelina, y el 60,6 % respondió exclusivamente a la flagelina. Esta observación de que casi dos tercios de las neuronas activadas por infusiones colónicas respondieron específicamente a la flagelina sugiere la existencia de un circuito neuroepitelial único para la detección de la flagelina, independiente de las vías implicadas en la detección de nutrientes. Si bien estudios futuros deberían investigar las neuronas que responden tanto a intralípidos como a la flagelina, estos resultados destacan una vía distinta para la señalización intestino-cerebro en respuesta al patrón microbiano de la flagelina.

Células PYY rugosas
El descubrimiento de un circuito neuroepitelial para detección rápida de un patrón microbiano en el colon nos llevó a investigar cómo la flagelina influye en tiempo real. Se planteo que la presencia de flagelina en el colon provocaría rápida disminución de la ingesta de alimentos. Para comprobarlo, dejamos en ayunas a ratones durante la noche para inducir el hambre y luego les administramos flagelina (1 μg ml−1, 0,1 ml) o un control con PBS mediante enema. Descubrimos que un enema de flagelina redujo significativamente la ingesta de alimentos (en 20 minutos) en ratones control de la misma camada, no tuvo efecto en ratones sin TLR5 en células marcadas con PYY.
Esta respuesta a la flagelina fue consistente en ratones jóvenes (5 semanas) y adultos (10 semanas), lo que sugiere que esta vía sensorial se conserva durante todo el desarrollo. La flagelina provocó una disminución temporal de la ingesta de alimentos, que se disipó después de 3 horas.
La inhibición farmacológica de TLR5 o del receptor Y2 previno la reducción de la ingesta de alimentos inducida por la flagelina. Estos datos sugieren firmemente que la flagelina luminal suprime rápida y reversiblemente la ingesta de alimentos al actuar sobre TLR5 y desencadenar la liberación de PYY dentro de este circuito neuroepitelial. Para analizar la conducta alimentaria con mayor precisión, desarrollamos un sistema conductual mediante grabaciones de vídeo y audio. El sistema, denominado Crunch Master, permite cuantificar automáticamente las sesiones de mordida individuales en tiempo real. Este análisis reveló que un enema de flagelina retrasó el inicio de la alimentación y redujo el consumo total de alimentos sin afectar la frecuencia ni la duración de la ingestión en un período de una hora. Esto demuestra además que la estimulación colónica con flagelina modula la conducta alimentaria en tiempo real.
Cabe destacar que los niveles de flagelina administrados mediante enema se encontraban dentro del rango de concentraciones fisiológicas encontradas en ratones alimentados en comparación con ratones en ayunas.
Además, los ratones no mostraron signos de malestar, diarrea, dolor ni limitaciones físicas, y no se observó un aumento significativo en la expresión de citocinas en el colon ni en el bazo en la hora posterior al enema.
Por lo tanto, la detección neuroepitelial de la flagelina reduce la ingesta de alimentos en ausencia de respuesta inmunitaria.
Finalmente, para confirmar que los efectos de la flagelina en la ingesta de alimentos se debían a la activación directa de las células epiteliales y no a interacciones con microorganismos intestinales, administramos un enema de flagelina a ratones libres de gérmenes. Si bien los ratones libres de gérmenes pueden presentar variaciones de comportamiento en comparación con los animales criados convencionalmente60, constituyen un modelo útil para estudiar este circuito neuronal intestino-cerebro sin microbioma. Los resultados muestran que un enema de flagelina redujo significativamente la ingesta de alimentos en estos ratones libres de gérmenes en una hora. Demuestra que la detección directa de flagelina por las células epiteliales del colon es suficiente para suprimir la ingesta de alimentos, independientemente de otras señales microbianas.
En conjunto, estos hallazgos demuestran que la percepción intestinal del patrón microbiano de la flagelina regula la alimentación.

Conclusión
Este circuito neuronal intestino-cerebro constituye la base de un «sentido neurobiótico», un sentido mediante el cual el huésped ajusta su comportamiento mediante el monitoreo de un patrón microbiano intestinal. Si bien investigaciones previas se han centrado en la transducción sensorial de nutrientes en el intestino delgado4,16,17,19, descubrimos que las células colónicas especializadas, las células neuropodales marcadas con PYY, utilizan el receptor de reconocimiento de patrones TLR5 para detectar la flagelina bacteriana. Estas células envían señales rápidas al cerebro, a través del nervio vago, para regular la conducta alimentaria.
Es importante reconocer que se utilizó un tipo de flagelina de Salmonella typhimurium, un patógeno estereotípico. Sin embargo, las bacterias pueden ser patógenas o comensales según la variante específica de flagelina expresada45. Por lo tanto, los efectos de otras variantes moleculares de la flagelina merecen investigación. Las investigaciones futuras deberían aprovechar las tecnologías en desarrollo para la modulación en tiempo real de las poblaciones microbianas para investigar los efectos de las fluctuaciones de la flagelina independientemente de la inducción exógena.
Así como los organismos dependen de la vista, el oído, el olfato, el gusto y el tacto para desenvolverse en el mundo, también ajustan su comportamiento en respuesta a los estímulos que moldean su intestino7.

NOTA: el presente es gran parte de la publicación original. Texto completo y detallado, tablas, figuras y referencias completas se pueden consultar en la revista mencionada al comienzo.

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