LABORATORIO DE URGENCIAS

Variables que Afectan las Pruebas de Coagulación

Andrew Goodwin*, MD, and Eric Salazar**, MD, PhD
   Members of the CAP Hemostasis and Thrombosis Committee
   * Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Vermont Larner College of Medicine.
   ** Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas Health San Antonio; medical director of clinical laboratories, UT Health 
        Multispecialty and Research Hospital and section chief of the hemostasis and thrombosis laboratory at University Hospital.

CAP – Today (July 2025) - Opinión de Expertos

Resumido por:  Amy Carpenter

Las variables que afectan las pruebas de coagulación son numerosas, desde las preanalíticas hasta las postanalíticas. En un curso del CAP del año pasado, los ponentes repasaron algunas de ellas, fundamentales para la seguridad del paciente.
Los autores estudiaron la lista de verificación de acreditación del CAP y las deficiencias de inspección más comunes, escanearon los prospectos y las recomendaciones publicadas, y consultaron a sus colegas del comité sobre sus propias prácticas de laboratorio.
Desde la estabilidad de las muestras hasta las interferencias y los cálculos, destacaron los detalles importantes y la transición de un laboratorio hacia la automatización. La sexta edición de “CLSI H21: Recolección, Transporte y Procesamiento de Muestras de Sangre para la Prueba de Ensayos de Coagulación con Plasma”, publicada el año pasado, contiene actualizaciones importantes relacionadas con la estabilidad de las muestras.
Para el fibrinógeno, el dímero D y el tiempo de trombina, el tiempo de estabilidad de las muestras pasó de cuatro horas en la quinta edición a 24 horas en la sexta. El tiempo de antitrombina pasó de cuatro horas en la quinta edición y es de 72 horas en la sexta, y algunos ensayos de factores pasaron de cuatro a más de 48 horas. Estas directrices actualizadas se basan en literatura revisada por pares.
El tiempo de estabilidad de la heparina no fraccionada no cambió; se mantiene en una hora a menos que el tubo de recolección contenga CTAD.
Es importante que los laboratorios reconozcan que la estabilidad de la heparina disminuye drásticamente después de una hora.
Una plaqueta activada libera factor plaquetario 4, que neutraliza la heparina y resulta en una concentración medida más baja en el laboratorio.
Las muestras de sangre completa deben centrifugarse para obtener plasma pobre en plaquetas en una Hora de la recolección. Si aún utiliza un método basado en TTP y no lo tiene seleccionado para la monitorización de heparina, y su estabilidad es de cuatro horas, los niveles de heparina empezarán a verse afectados si no procesa esos TTP para la monitorización de heparina de forma rápida. Los datos publicados muestran que la estabilidad de la heparina puede extenderse más allá de una hora en algunas circunstancias. Su laboratorio realizó un estudio de estabilidad interno para monitorizar el resultado inicial de heparina, seguido de los niveles de heparina en diferentes momentos. Él y sus colegas diseñaron un estudio de este tipo para su ensayo cromogénico anti-Xa y descubrieron una disminución insignificante de la estabilidad de la heparina a los 75 minutos y una disminución clínicamente significativa entre los 90 minutos y las dos horas.
Se conseja es conocer las directrices más recientes sobre estabilidad de las muestras, consultar el prospecto para la estabilidad, desarrollar protocolos que reflejen las mejores prácticas de estabilidad y tener precaución cuando el laboratorio tenga muchos requisitos de estabilidad distintos.

La norma HEM.37175 del listado de verificación de acreditación de hematología y coagulación del CAP. Exige que el laboratorio mida el recuento plaquetario real del plasma pobre en plaquetas utilizado en numerosas pruebas de coagulación al menos una vez al año y después de un mantenimiento o servicio importante de la centrífuga.
Este requisito es el que se cita con mayor frecuencia como deficiencia en los laboratorios de coagulación. Se citó 32 veces en un año, lo que representa el 1,6 % de los laboratorios. Es la deficiencia más común en los laboratorios de coagulación.
Las plaquetas pueden liberar micropartículas/fosfatidilserina, fibrinógeno, factores V y VIII, factor de von Willebrand y factor plaquetario 4, todos los cuales pueden neutralizar la heparina y afectar a otras pruebas de coagulación. Por lo tanto, es importante eliminar las plaquetas residuales si se van a realizar pruebas de coagulación.
El plasma pobre en plaquetas se define como un valor inferior a 10 × 109/L. La activación plaquetaria puede resultar de una congelación-descongelación, el enfriamiento de la muestra, la hemólisis o el uso de un sistema de tubos neumáticos. Las plaquetas activadas liberan fosfolípidos procoagulantes que pueden neutralizar los inhibidores del lupus, que a su vez se unen a los fosfolípidos procoagulantes. Cabe destacar que los anticoagulantes lúpicos son anticuerpos antifosfolípidos, lo cual puede dar lugar a un falso negativo si el recuento de plaquetas en la prueba de anticoagulante lúpico es demasiado alto. Los factores de coagulación pueden afectar los ensayos de coagulación tradicionales, aunque estudios han demostrado que los ensayos de TTPA, TP/INR y tiempo de trombina realizados en muestras frescas no parecen verse afectados por un recuento de plaquetas de hasta 200 × 109/μL. Esto no aplica a las muestras evaluadas para terapia con heparina o inhibidores del lupus.
El CAP, el CLSI y otros generalmente recomiendan un enfoque conservador. Asegúrese de tener plasma pobre en plaquetas si va a utilizar esa muestra para este tipo de prueba. Mantenga el nivel de plaquetas en el plasma pobre en plaquetas bajo y asegúrese de validarlo en los momentos adecuados.
Se recomienda seguir un protocolo de verificación de plasma pobre en plaquetas, como el del CLSI H21. Se toma un tubo tapado y se centrifuga a una velocidad y tiempo que resultan en un plasma pobre en plaquetas, <10 × 109/L de plaquetas. El laboratorio debe establecer la velocidad, el tiempo y Variará según la centrífuga utilizada. El protocolo de centrifugación más común es de 1500 g durante 15 minutos. Otros protocolos publicados indican un tiempo de centrifugación más corto a una velocidad mayor (4400 g).
Se está debatiendo en el Comité de Hemostasia y Trombosis del CAP y con otros sobre qué tan altas podemos alcanzar con la velocidad de centrifugación y las fuerzas g. Sin embargo, actualmente no comprendemos bien los límites aceptables de la fuerza centrífuga. Se está realizando un estudio que podría derivar en un nuevo estándar en el futuro.
El recuento de plaquetas debe verificarse con un contador celular automatizado. Si no se alcanza el recuento residual, considere una doble centrifugación, transfiera el plasma a un segundo tubo y centrifugue de nuevo.
Los requisitos de la lista de verificación del CAP abordan los estudios de la función plaquetaria. La norma HEM.38350 sobre manipulación de muestras indica que las muestras de sangre para estudios de agregación plaquetaria y función plaquetaria deben manipularse a temperatura ambiente antes de la prueba. La norma HEM.38300 sobre Estudios de la Función Plaquetaria requiere la agregación plaquetaria o pruebas iniciales de la función plaquetaria. debe realizarse dentro de un período apropiado después de la venopunción.
Los tiempos de transporte de las muestras no pueden superar la estabilidad del analito a medir. Para la mayoría de las pruebas de función plaquetaria, este tiempo suele ser de cuatro horas, tenga en cuenta y siga las instrucciones del fabricante.
La guía CLSI H58-A, Pruebas de Función Plaquetaria por Agregometría (Directriz Aprobada), indica que la entrega en mano es el modo de transporte preferido para estas muestras.
Un par de estudios, uno de los cuales encontró que los parámetros de PFA-100 y agregometría se prolongaron mediante el transporte con tubo neumático en pacientes que tomaban aspirina (Dyszkiewicz-Korpanty A, et al. J Thromb Haemost. 2004;2[2]:354–356).
Otro estudio encontró que el tiempo de formación del coágulo de TEG fue menor en las muestras transportadas mediante tubo neumático (Wallin O, et al. Clin Chem Lab Med. 2008;46[10]:1443–49).
Para las pruebas de función plaquetaria, si utiliza un sistema de tubo neumático para el transporte de muestras, considere validar su uso. Y a medida que los hospitales crecen y se expanden los sistemas de tubos, es posible que desee revalidar. Para las pruebas de coagulación de rutina, los sistemas de tubos tienden a ser aceptables.

Entre los problemas de muestra relacionados con método de análisis óptico se encuentran las interferencias de hemólisis, ictericia y lipemia. Algunos analizadores de coagulación más recientes cuentan con un sistema de detección automatizado que proporciona mediciones objetivas de HIL.
El método foto-óptico es bastante sensible a la interferencia de HIL, en particular a la hemólisis. Cualquier interferencia con el componente fotoóptico se vuelve problemática y podría resultar en resultados menos precisos.
El método electromecánico es menos vulnerable a la interferencia analítica de HIL, aunque la hemólisis podría indicar una calidad de muestra subóptima.
La directriz CLSI H21 recomienda consultar el prospecto del fabricante para conocer los límites de interferencia específicos para cada analito de coagulación.
Las directrices y literatura abordan extensamente la hemólisis, indicando que no solo es una posible interferencia óptica, sino que también pone en duda la integridad de la muestra.
La directriz CLSI H21 también indica que si se genera hemólisis debido a una extracción de sangre traumática, un desplazamiento violento en un tubo neumático o por cualquier otra razón, esto indica que se podría haber activado el sistema de coagulación o realizado algo que comprometiera la muestra. Identifica los ensayos más afectados por la evidencia de hemólisis que podría deberse a un traumatismo en la muestra, incluyendo fibrinógeno, dímero D, antitrombina, anti-Xa y anticoagulante lúpico.
El Consejo Internacional de Normalización en Hematología recomienda que el plasma para pruebas de coagulación preparado a partir de muestras de sangre citrada se analice para detectar la presencia de hemólisis in vitro, preferiblemente mediante un sistema automatizado para garantizar la consistencia (Kitchen S, et al. Int J Lab Hematol. 2021;43[6]:1272–1283).
También recomienda que no se realice el TTPA en muestras con hemólisis ocurrida in vitro durante la recolección, el transporte y el procesamiento de la muestra. Además, indican que el TP no parece verse tan afectado.
Otra recomendación del ICSH indica que se debe considerar la posibilidad de que se haya producido hemólisis in vivo y que se pueden aceptar y analizar muestras de pacientes con hemólisis in vivo para la determinación de pruebas de coagulación. Por lo tanto, indican que la etiología de la hemólisis debería ser uno de los puntos de decisión para aceptar o no esa muestra. Esto puede ser un desafío, especialmente para un laboratorio de referencia.
Para la lipemia, muchos laboratorios cuentan con un proceso de ultracentrifugación y realizan la ultracentrifugación si presentan altas cantidades de triglicéridos o lipemia en la muestra.
En un estudio, se descubrió que la ultra-centrifugación tuvo un impacto en los niveles de factor von Willebrand y factor VIII. Los resultados de actividad de vWF fueron un promedio de 31.9% más bajos, los resultados de antígeno de vWF fueron un promedio de 12.1% más bajos y los niveles de FVIII fueron un promedio de 23.2% más bajos. El impacto en el TTPA fue mínimo.
Estas son proteínas grandes que se liberan en la ultracentrifugación. Por lo tanto, ya no informamos los resultados de vWF o FVIII en muestras ultracentrifugadas para lipemia.
Los efectos podrían no ser necesariamente clínicamente relevantes, añadió. Sin embargo, si una actividad de von Willebrand es ligeramente superior a 50 y se informa por debajo de 50, cruza el umbral clínicamente relevante de normal a anormal.
Para la ictericia, algunos laboratorios han desarrollado protocolos de dilución para minimizar la interferencia.
Para los ensayos de factor, realizamos múltiples diluciones para identificar sustancias interferentes y, si logramos diluirlas, informaremos el resultado. Cabe destacar que es una práctica que algunos laboratorios han adoptado. (El HEM.37980 aborda los criterios del ensayo de factor).
En resumen, comprender las interferencias del instrumento, revisar la bibliografía para encontrar el mejor enfoque estandarizado para el manejo de muestras de HIL y garantizar que la bibliografía incluya el instrumento o reactivo específico de su laboratorio, además de investigar la etiología de la hemólisis, especialmente cuando es constante en un solo paciente. Su laboratorio reconoce que ciertas poblaciones de pacientes están sujetas a hemólisis in vivo, como aquellos sometidos a trombólisis mecánica intravascular o soporte circulatorio.
En algunos laboratorios, si detectamos hemólisis por debajo del umbral, emitiremos un comentario indicando que se detectó hemólisis, pero publicaremos el resultado. Si supera el umbral indicado en las instrucciones de uso, rechazamos la muestra. En pacientes con hemólisis in vivo, se utiliza un protocolo según el cual, si el instrumento proporciona un resultado, este se le comunicará al profesional sanitario en un comentario, explicando que podría ser inexacto. Este profesional intenta citar la literatura y explicar el impacto específico que la hemólisis puede tener en los resultados de la prueba.En el laboratorio del Dr. Goodwin, el valor de corte para la hemólisis es de 325 mg/dL y cuando supera ese nivel. A menudo, no publicamos ese resultado o lo publicamos con una exención de responsabilidad al determinar la hemólisis in vivo.
El indicador clave para investigar la hemólisis in vivo es cuando, tras dos intentos de recolección, la hemólisis persiste. Por último, es importante revisar la información del instrumento, como la curva de coagulación, junto con la línea base y el cambio en las lecturas de miliabsorbancia.
Las interferencias comunes del dímero D son bien conocidas: hemoglobina libre, hiperbilirrubinemia, hipertrigliceridemia y factor reumatoide (aunque muchos sistemas de reactivos añaden un agente bloqueador del factor reumatoide para mitigar el impacto).
El ensayo del dímero D es un inmunoensayo mejorado con látex, y cuando la muestra que contiene el dímero D se añade al sistema de reactivos, este se une a y aglutinan las microesferas de látex, lo que se refleja en el cambio en la mili-absorbancia medida por el instrumento. Los anticuerpos heterófilos interferentes, por ejemplo, se unen a las microesferas y causan aglutinación. Incluso con una baja concentración de dímero D, estos anticuerpos parecen causar aglutinación en las microesferas de látex y pueden sobreestimar el dímero D.
Una prueba para un paciente con una concentración muy alta de dímero D. Cuando se obtiene un resultado con una pendiente inicial muy acelerada [para el cambio en la miliabsorbancia] que luego se estabiliza, indica un exceso de antígeno y, a menudo, un dímero D por encima de su AMR. Se aconseja, colocar nota en el informe: "indicación por encima de AMR".
A menudo, cuando un resultado excede el rango de medición analítica, se realiza una dilución interna o de otro tipo con la expectativa de que la medición diluida se encuentre dentro del AMR (el resultado informado se corrige para la dilución).
En la muestra en cuestión, el resultado va de superior a inferior al AMR, y nuestras diluciones no están configuradas para ello. No tenía sentido. El laboratorio realizó otra recolección de muestra del paciente y hubo una investigación exhaustiva con el fabricante. Hicieron una muestra dividida del dímero D y la enviaron a otro laboratorio. (El paciente dio resultados normales con un método de análisis diferente y ligeramente elevados en el otro laboratorio con el mismo instrumento y un reactivo distinto). La duda radica en si el paciente tenía anticuerpos que afectaran al anticuerpo monoclonal presente en las microesferas de látex.
El fabricante tras varios estudios, identificó lo que etiquetó como un anticuerpo heterófilo que no era anti-ratón, anticabra ni anticonejo, pero que interfería con el ensayo.
Además de las interferencias comunes del dímero D, su laboratorio incluye en su protocolo un anticuerpo heterófilo que inicialmente detecta un exceso de antígeno (por encima del RNA y, tras la dilución, desciende por debajo del RNA).
Esto ha ocurrido en algunos pacientes desde 2016, y en estas muestras, el laboratorio informa: "No se puede realizar el ensayo debido a la interferencia".
El laboratorio recomienda que el proveedor solicitante realice el siguiente paso de su protocolo. Puede enviarlo a otro laboratorio que utilice un anticuerpo monoclonal diferente en su sistema.
Consejo: Comprenda los RNA del laboratorio para el dímero D y busque muestras que inicialmente estén por encima y luego desciendan por debajo del RNA tras la dilución. Y tenga en cuenta que los anticuerpos heterófilos son otra posible fuente de interferencia del dímero D.

Middleware y automatización con un breve análisis de reglas implementadas
Los ensayos de factor tradicionales requieren múltiples diluciones e interpretación.
El criterio de ensayo de factor HEM.37980 exige que se grafiquen tres o más diluciones para cada ensayo de actividad de factor funcional para detectar disparalelismo y que se informe.
El criterio de interferencia de inhibidor HEM.37984 exige que el laboratorio informe la actividad de factor más alta aparente con dilución si se observa interferencia de inhibidor inespecífica en un ensayo de actividad de factor.
El disparalelismo sugiere un inhibidor, citando como ejemplo datos de un artículo de 2017 (Riley PW, et al. J Pathol Inform. 2017;8[1]:25). En las pruebas de actividad de factor de coagulación, la calibración corregida (posdilución) y los resultados del paciente son paralelos y muestran un resultado consistente en cada dilución.
Por otro lado, si se diluye al paciente y comienza a recuperar cada vez más actividad, esto puede sugerir algún tipo de inhibidor, afirmó. Múltiples interferencias en un ensayo de factor de coagulación de una sola etapa pueden provocar esto, afirmó, señalando inhibidores inespecíficos como los anticoagulantes lúpicos, así como inhibidores farmacéuticos de anticoagulantes como la heparina, los anticoagulantes orales directos o los inhibidores directos de la trombina.
La mayoría de los inhibidores de factores específicos, como los observados en la hemofilia adquirida, no suelen causar disparalelismo. Generalmente, se consideran inhibidores inespecíficos del factor VIII.
Realizar estas tres diluciones y determinar qué valor reportar puede ser complicado en el contexto del disparalelismo, pero el middleware puede facilitar las cosas. Y estas reglas de middleware pueden tener un gran impacto en las operaciones del laboratorio.
Riley et al. informaron en su artículo de 2017 en J. of Pathology Informatics sobre varias ventajas de implementar reglas de autoverificación para expertos en las pruebas de actividad de factores de coagulación: facilidad de capacitación, minimización del tiempo requerido por los técnicos, reducción de la fatiga del personal y mayor consistencia y calidad, entre otras. La implementación de reglas de middleware redujo el gasto total de mano de obra en aproximadamente un cuatro por ciento.
En el Centro Médico de la Universidad de Vermont, tiene un volumen anual de muestras del laboratorio de 53,000 y recibe 73,060 muestras. Veintitrés técnicos de tiempo completo (FTE) gestionan las secciones de hematología y coagulación.
El UVMMC es un centro regional de tratamiento de hemofilia, un centro de traumatología de nivel uno y un centro de accidentes cerebrovasculares de nivel platino; el laboratorio apoya estos servicios, así como un activo Programa de Trombosis y Hemostasia.
En 2021, el software de Windows XP de los tres analizadores del laboratorio para pruebas de coagulación rutinarias y especializadas dejó de ser compatible. Esto nos obligó a tomar una decisión: obviamente, actualizar nuestros instrumentos, pero planteó la pregunta: ¿queremos considerar la automatización en este momento?
Para justificar la automatización, se centró en las finanzas, la dotación de personal, el alcance de los servicios y el potencial de mejora en los tres aspectos.
La dirección del laboratorio solicitó la opinión de quienes realizan las pruebas. El proceso manual es ineficiente y conlleva problemas ergonómicos. La opinión del grupo de recepción de muestras: "Todo está bien".
Flebotomía consideró que las tasas de rechazo eran altas y que, a menudo, era subjetiva.
Un análisis del flujo de trabajo contabilizó 38 pasos del proceso y 10 puntos de decisión en el flujo de trabajo manual del laboratorio. "Eso es mucho, porque 10 puntos de decisión ofrecen 10 oportunidades para tomar la decisión equivocada, y 38 pasos del proceso representan 38 veces la probabilidad de que la muestra se manipule incorrectamente". Optimizar el flujo de trabajo para mejorar la eficiencia, mitigar las lesiones por uso excesivo y repetitivo, y aportar objetividad a la evaluación de muestras para HIL y volumen de llenado, por ejemplo, fueron los principales objetivos, al igual que minimizar las repeticiones de extracción, las cancelaciones de pruebas y reducir o eliminar las interferencias y las muestras subóptimas.
En siete años de uso de una línea automatizada, el laboratorio ahorraría 1.233 millones de dólares en gastos, principalmente en mano de obra, lo que permitiría ampliar el alcance de los servicios del laboratorio. Con esto, podemos realizar más pruebas y entregarlas rápidamente a los pacientes.
Tras la automatización, el flujo de trabajo pasó de 38 pasos de proceso y 10 puntos de decisión a 10 pasos de proceso y un punto de decisión. Fue un cambio enorme. Y, esencialmente, eliminamos la exposición a riesgos biológicos para los técnicos, ya que ya no tenían que destapar las muestras para las pruebas de rutina.
Los técnicos utilizan la línea automatizada el 98 % del tiempo, y no hay diferencia en lo que introducen. Uno pensaría que están introduciendo todas las estadísticas allí; No. Algunas muestras requieren carga anticipada, la mayoría se colocan en la línea automatizada.
El enfoque de automatización no fue descendente. El personal técnico diseñó la línea de automatización y estuvo a cargo de la implementación.
Alguien fue el líder de gestión de cambios y trabajó con el personal del laboratorio para crear cinco equipos de implementación de la línea de automatización: flujo de trabajo, agilidad, procedimiento, competencia y supervisión.
Se ha observado un impacto positivo significativo en el personal de segundo y tercer turno, ya que no tienen que interactuar tanto con las muestras de coagulación.
El alcance de los servicios del laboratorio se está ampliando con nuevas pruebas: apixabán y rivaroxabán, inmunohistoquímica de la sangre (HIT) diagnóstica, mediciones directas de inhibidores de la trombina (LDT), resistencia a la proteína C activada, proteína S libre y proteína C cromogénica.
El tiempo de respuesta se redujo mucho, los flujos de trabajo son más sencillos, la monitorización de HIL proporciona una mejor comprensión y la satisfacción laboral ha aumentado.
El middleware es extremadamente potente y ofrece la posibilidad de añadir reglas reflejas personalizables en el sistema.