LABORATORIO DE URGENCIAS

Rastros de Microbios en Tumores Cerebrales

Golnaz Morad, Ashish Damania, Brenda Melendez, Bharat B. Singh, Fabiana Veguilla, Rebecca Soto, Yasmine, Hoballah, Pranoti, Sahasrabhojane, Matthew Wong, Mona  Ahmed, Jennifer A. Wargo et al 

Nature Medicine (2025); volume 31, pages3675–3688

Los gliomas y las metástasis cerebrales se asocian con un mal pronóstico, lo que requiere una comprensión más profunda de la biología de los tumores cerebrales y el desarrollo de estrategias terapéuticas efectivas. Si bien nuestro grupo y otros han demostrado la presencia microbiana en varios tumores, las controversias recientes con respecto a la microbiota intratumoral específica del tipo de cáncer enfatizan la importancia de una validación ortogonal rigurosa. Este estudio prospectivo y multiinstitucional incluyó un total de 243 muestras de 221 pacientes, que comprendían 168 muestras de gliomas y metástasis cerebrales y 75 tejidos no cancerosos o adyacentes a tumores. Mediante hibridación in situ con fluorescencia rigurosa, inmunohistoquímica e imágenes espaciales de alta resolución, detectamos ARNr 16S bacteriano intracelular y lipopolisacáridos en muestras de gliomas y metástasis cerebrales, localizados en células tumorales, inmunes y estromales. Los flujos de trabajo personalizados de secuenciación 16S y metagenómica identificaron taxones asociados con señales bacterianas intratumorales en el microambiente tumoral; Sin embargo, los métodos de cultivo estándar no permitieron obtener una microbiota fácilmente cultivable. Los análisis espaciales revelaron correlaciones significativas entre las señales bacterianas 16S y las firmas antimicrobianas e inmunometabólicas a nivel regional, local y celular. Además, las señales bacterianas 16S intratumorales mostraron una superposición de secuencias con la microbiota oral e intestinal coincidente, lo que sugiere una posible conexión con comunidades distantes.
En conjunto, estos hallazgos introducen elementos microbianos como un componente del microambiente tumoral cerebral y sientan las bases para futuros estudios mecanísticos y translacionales.
Los gliomas, incluidos los glioblastomas (GBM) y las metástasis cerebrales (BrM), representan las formas más comunes de neoplasias malignas cerebrales en adultos1,2. El pronóstico de los pacientes con tumores cerebrales primarios o metastásicos sigue siendo difícil a pesar de la terapia máxima con cirugía, radioterapia y tratamientos sistémicos. Comprender las complejidades del microambiente tumoral cerebral (TME) e identificar los factores que configuran el entorno inmunitario tumoral es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la biología tumoral cerebral y mejorar el pronóstico de esta enfermedad. La microbiota se ha convertido en un importante regulador de la inmunidad tumoral. Estudios recientes han demostrado la presencia de células microbianas y material genético dentro del tejido tumoral en diversos tipos de cáncer4 e investigado su papel mecanístico en la progresión del cáncer, específicamente en la infiltración inmunitaria tumoral5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la presencia de una microbiota específica para cada tipo de cáncer en todos los principales tipos de cáncer humano ha sido objeto de debate reciente11,12,13, debido principalmente a las limitaciones inherentes a los métodos computacionales utilizados para detectar y clasificar muestras microbianas de baja abundancia13. En consecuencia, los hallazgos derivados únicamente de análisis bioinformáticos deben interpretarse con cautela y complementarse con métodos de validación. Es importante destacar que los términos «microbiota» o «microbioma» deben reservarse para describir una comunidad diversa y activa de microorganismos en un entorno, respaldada por evidencia sólida.
En este contexto, estudios iniciales han aportado evidencia de la presencia de elementos microbianos en tumores cerebrales. Específicamente, se han detectado ácidos nucleicos bacterianos en GBM y metástasis del sistema nervioso central (SNC)4,14,15. Además, se encontró que los tumores de GBM albergan péptidos bacterianos unidos a HLA de clase II, reconocidos por los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL)16. Sin embargo, la posibilidad de que una microbiota diversa pueda infiltrarse y existir dentro del EMT cerebral sigue siendo un área de investigación activa.
En este estudio, implementamos enfoques experimentales y bioinformáticos complementarios robustos para investigar la presencia de microorganismos y elementos microbianos en cohortes prospectivas multiinstitucionales de individuos con glioma y BrM. No observamos evidencia de una comunidad bacteriana cultivable, lo que sugiere la posible ausencia de una microbiota tumoral en tumores cerebrales. No obstante, mediante extensas técnicas de imagenología de alta resolución, validamos la presencia de elementos bacterianos intracelulares (ARN, ADN y componentes de membrana) en el EMT cerebral. Además, aprovechamos las tecnologías espaciales y demostramos la correlación de las señales bacterianas intratumorales con distintas firmas antimicrobianas e inmunometabólicas. Por último, utilizamos rigurosas metodologías bioinformáticas para caracterizar las señales bacterianas intratumorales y demostrar una correlación con el microrgamismo distante.

RESULTADOS

Señales bacterianas 16S detectables en tumores cerebrales primarios y metastásicos
Para determinar y validar la presencia, distribución y relevancia biológica de bacterias y elementos bacterianos en tumores cerebrales primarios y metastásicos, aplicamos un riguroso proceso de trabajo que integra enfoques experimentales y bioinformáticos complementarios, incluyendo hibridación in situ con fluorescencia (FISH), inmunohistoquímica (IHQ) e imagen molecular espacial (SMI) para la detección de señales; análisis culturómicos y bioinformáticos para la caracterización; y SMI y perfil espacial digital (DSP) para el análisis funcional.
El estudio incluyó 243 muestras de tejido de un total de 221 pacientes (168 tumorales: 113 gliomas, 55 BrM; 22 tejido normal adyacente al tumor (NAT); y 53 tejido cerebral no canceroso). Cuando se dispuso de suficiente material, se analizaron las muestras tumorales utilizando al menos dos métodos en las siguientes categorías: visualización, secuenciación y culturómica. En total, 33 de 113 muestras de glioma y 23 de 55 de BrM se evaluaron mediante métodos en al menos dos categorías diferentes.
Primero, realizamos la técnica FISH con RNAScope en secciones de tejido completo de 15 muestras de glioma y 15 de BrM, utilizando sondas panbacterianas de ARNr 16S validadas7 junto con una sonda de control negativo. Se detectaron señales distintivas de ARNr 16S en 11 tumores de glioma y nueve de BrM.  Las imágenes de z-stack detectaron señales de ARNr 16S en las proximidades del núcleo, lo que sugiere una localización intracelular. La cotinción con la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; glioma) o los marcadores de membrana de pancitoqueratina (BrM) revelaron diversos patrones de localización del ARNr 16S bacteriano, incluyendo distribuciones citoplasmáticas, adyacentes a la membrana y extracelulares.
Cabe destacar que las señales del ARNr 16S variaron en tamaño y morfología, con algunas consistentes con bacterias intactas (aproximadamente 2 μm) y otras exhibiendo patrones puntiformes, lo que sugiere la posible presencia tanto de células bacterianas intactas como de ARNr 16S bacteriano fragmentado.
Para investigar más a fondo la presencia de elementos bacterianos, realizamos tinción de lipopolisacárido (LPS) en secciones de tejido consecutivas a las utilizadas para la FISH del ARNr 16S. Se detectó LPS en 13 muestras de glioma y nueve de BrM, con patrones de tinción que sugieren localización tanto intra como extracelular. Cabe destacar que los resultados de la tinción FISH de ARNr 16S y LPS fueron concordantes en 22 de 30 muestras (n = 18 positivos y n = 4 negativos con ambos métodos).
Los hallazgos discordantes en las muestras restantes podrían reflejar diferencias en la estabilidad o degradación del ARN bacteriano y las proteínas en secciones secuenciales de tejido. Para evaluar si estas señales bacterianas eran específicas del tejido tumoral, examinamos a continuación controles no tumorales. No se detectó señal de ARNr 16S bacteriano en una micromatriz de tejido cerebral sano recién cortada.
También evaluamos la señal de ARNr 16S y la tinción de LPS en NAT (n = 14). Aunque la señal de ARNr 16S se detectó solo en cuatro muestras, la tinción de LPS fue positiva en 12 de 14 muestras y se observó tanto en las regiones perivasculares como parenquimatosas. Para evaluar las señales bacterianas 16S identificadas con mayor resolución y examinar su distribución espacial dentro del TME cerebral, realizamos una SMI utilizando la plataforma CosMx (Bruker Spatial Biology). La SMI se realizó en dos TMA construidas a partir de tumores de glioma y BrM, y se utilizó el Panel de Descubrimiento Humano 6K junto con un panel personalizado de sondas 16S panbacterianas. La señal intratumoral 16S se detectó tanto intracelularmente como en el entorno extracelular. Si bien no se puede ignorar la posible importancia biológica de las señales extracelulares 16S, las tecnologías actuales son limitadas para distinguir con precisión entre la verdadera señal extracelular de ARNr 16S y la posible contaminación introducida durante el procesamiento tisular (por ejemplo, fijación e inclusión de tejido). Por lo tanto, consideramos exclusivamente las señales intracelulares 16S para el análisis.
Para garantizar una verdadera localización intracelular, excluimos las células donde las señales bacterianas 16S se encontraban cerca de la membrana celular, ya que dicha proximidad, combinada con las limitaciones inherentes a la segmentación celular, podría generar patrones intracelulares falsos positivos. Por lo tanto, solo las células en las que la posición bacteriana media 16S estaba dentro del 50% central de todas las posiciones de transcripción en todos los ejes x, y y z (es decir, centradas dentro del cuerpo celular) se consideraron células 16S-positivas de alta confianza.
De las 28.177 y 65.993 células analizadas en todos los núcleos en gliomas y TMA de BrM, identificamos un total de 182 (0,65%) y 198 (0,3%) células con señal intracelular 16S de alta confianza, respectivamente.
La señal intracelular 16S presentó patrones de distribución heterogéneos entre los tumores y campos de visión (FOV) analizados, lo que sugiere una distribución no aleatoria. En primer lugar, las diferentes muestras tumorales mostraron variación en el recuento de la señal intracelular 16S por paciente (glioma, promedio: 1098,2; rango: 25-4236; BrM, promedio: 943,6; rango: 30-2706) y en el número total de células 16S-positivas detectadas por paciente (glioma, rango: 0-27; BrM, rango: 1-62).
Este patrón de distribución no se relacionó con la posición del núcleo tisular en la TMA. Además, la señal intracelular de 16S en gliomas y BrM mostró una densidad 16 veces y 67,5 veces mayor, respectivamente, en comparación con la señal de 16S en el entorno extracelular, lo que probablemente se deba a la contaminación con una distribución tisular aleatoria esperada (densidad media de la señal intracelular por μm²: glioma 7,52 × 10−3, BrM 7,56 × 10−3; señal media extracelular de 16S por μm²: glioma 4,78 × 10−4, BrM 1,13 × 10−4).
Nuestras observaciones nos impulsaron a examinar los tipos de células que albergan la señal intracelular de 16S. Tanto en los TMA de gliomas como de BrM, se detectaron señales intracelulares de 16S bacterianas en células tumorales, así como en diversas células inmunitarias y del estroma.
En conjunto, los análisis molecular exhaustivo de muestras de glioma y BrM mediante FISH con 16S RNAScope, tinción con LPS y SMI de alta resolución demostró que se pueden detectar elementos bacterianos intracelulares en el TME cerebral.
A continuación, evaluamos si la señal bacteriana detectada en el TME cerebral podía atribuirse a bacterias cultivables. Preparamos homogeneizados de nueve tumores recién resecados, 13 muestras tumorales recién congeladas y dos muestras cerebrales recién congeladas no cancerosas de personas con epilepsia.
Todas las muestras recién congeladas se evaluaron mediante SMI, secuenciación de amplicones 16S y/o secuenciación shotgun metagenómica, y se confirmó que contenían señal bacteriana 16S. En los tumores recién resecados, se dispuso de suficiente tejido en tres muestras para realizar la PCR de reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) del ARNr 16S después del cultivo, lo que confirmó la presencia de copias bacterianas de 16S (2,5-16 copias por microlitro). Los homogeneizados se sembraron en medios ricos en nutrientes, con o sin preenriquecimiento en caldo rico en nutrientes, y se sometieron a condiciones anaeróbicas y aeróbicas. En todas las condiciones, no se observó crecimiento bacteriano después de 14 días de cultivo.
Estos hallazgos sugieren que las muestras de tumores cerebrales y de cerebro no canceroso podrían carecer de bacterias fácilmente cultivables, según se evaluó mediante técnicas de cultivo estándar.

Se identificaron señales bacterianas distintivas en tumores cerebrales en comparación con tejido cerebral no canceroso.
Para caracterizar mejor las señales bacterianas intratumorales, reunimos cohortes prospectivas de muestras de gliomas y tumores de BrM de pacientes del MD Anderson Cancer Center (cohortes MDACC1 y MDACC2) y del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston (cohorte UTH), que se analizaron mediante secuenciación de amplicones de ARNr 16S (V3-V4). Para la comparación, incluimos una cohorte de tejido cerebral no canceroso resecado como parte de un procedimiento para la epilepsia farmacorresistente (cerebro no canceroso UTH). Dos muestras de glioma de la cohorte MDACC1 no lograron producir lecturas de secuenciación y fueron excluidas del análisis.
El análisis bioinformático de conjuntos de datos 16S de muestras que se anticipa que no tienen señal bacteriana o que la tienen en baja abundancia, como el tejido cerebral, plantea desafíos, en gran parte debido a los efectos de la contaminación13. Para detectar y minimizar el impacto de los contaminantes potenciales en nuestro análisis, aplicamos una serie de cinco pasos de filtración que apuntaron a eliminar los tipos más comunes de contaminación. Después de este proceso de filtración, el 46,6% de las muestras tumorales (55 de 118) y el 76,9% de las muestras cerebrales no cancerosas (10 de 13) no retuvieron ninguna señal bacteriana detectable. En las muestras restantes, se identificaron un total de 34 taxones bacterianos. Cabe destacar que, en consonancia con nuestra FISH 16S, se detectó una señal mínima en el tejido cerebral no canceroso. Estos hallazgos sugieren colectivamente la especificidad tumoral de la señal 16S intratumoral identificada. Entre los taxones bacterianos identificados, 16 se asociaron con la microbiota comensal humana, lo que representa una posible señal biológicamente significativa (variante de secuencia de amplicón [ASV]: tumor n = 59, cerebro no canceroso n = 2, taxones gramnegativos n = 12, taxones grampositivos n = 4); sin embargo, se encontró que 18 taxones eran contaminantes ambientales conocidos (ASV n = 53). Estos resultados resaltan las limitaciones inherentes asociadas con el análisis bioinformático de muestras de baja abundancia, lo que indica que incluso los métodos de filtración rigurosos no pueden eliminar todos los contaminantes.
En consecuencia, los datos taxonómicos obtenidos de los análisis bioinformáticos de muestras con baja biomasa justifican la validación
Nos preguntamos si los taxones identificados mediante la secuenciación del gen ARNr 16S podrían validarse con una cobertura génica más amplia. Se realizó una secuenciación metagenómica shotgun en 45 muestras tumorales (glioma n = 30, BrM n = 15). Las lecturas no humanas representaron un promedio del 0,056 % del total (rango: 0,03-0,09 %), de las cuales un promedio del 0,46 % correspondió a bacterias (rango: 0,002-2,13 %). Para complementar la cobertura 16S (V3-V4) obtenida mediante la secuenciación del ARNr 16S, la secuenciación metagenómica se filtró con la base de datos de genes de ARN ribosomal SILVA17, lo que garantizó que las taxonomías detectadas se derivaran de genes bacterianos no ribosomales. Aplicamos un flujo de trabajo de filtración para minimizar la inclusión de lecturas probablemente derivadas de contaminación, lo que eliminó el 43% y el 20% de las muestras de glioma y BrM, dejando un total de 29 y 24 especies (24 y 21 géneros) en 17 muestras de glioma y 12 de BrM, respectivamente. Este análisis obtuvo cobertura no ribosomal para cinco de los 16 géneros bacterianos identificados mediante la secuenciación del gen ARNr 16S, incluyendo Fusobacterium, Veillonella, Prevotella, Capnocytophaga y Enterococcus.
El análisis metagenómico fue concordante con nuestra secuenciación del amplicón 16S al detectar la presencia de señal bacteriana en nueve de las 16 muestras evaluadas con ambos métodos, con una correlación moderada en la riqueza bacteriana (ρ de Spearman = 0,59; P = 0,09). Siete muestras presentaron lecturas detectables mediante secuenciación metagenómica, pero no mediante secuenciación del amplicón 16S.
En conjunto, estos hallazgos proporcionan una cobertura génica más amplia de taxones bacterianos en tumores cerebrales, aunque no se pudieron recuperar genomas bacterianos completos, probablemente debido a la baja biomasa.
Para complementar nuestro enfoque bioinformático, utilizamos SMI para validar la localización intracelular de los taxones bacterianos identificados mediante secuenciación dirigida, utilizando tres conjuntos de sondas específicas de género para Fusobacterium, Porphyromonas y Prevotella. Detectamos señales intracelulares de los tres géneros, aunque con una frecuencia menor en comparación con la señal 16S panbacteriana.
En conjunto, los hallazgos revelan taxones bacterianos distintos en gliomas y BrM y confirman que al menos un subconjunto presenta localización intracelular. Sin embargo, determinar la significancia y la generalización de taxones individuales requerirá estudios a mayor escala.

Las regiones tumorales con alta señal de 16S se enriquecen con firmas antimicrobianas.
A continuación, utilizamos DSP (plataforma GeoMx; Bruker Spatial Biology) para examinar la asociación de la señal intratumoral de 16S con las firmas de proteínas y transcritos en el TME cerebral. La DSP se realizó en los TMA de glioma y BrM descritos previamente utilizando el Atlas de Proteoma de Inmuno-Oncología GeoMx (IPA), el Ensayo Transcriptómico Completo (WTA) (Bruker Spatial Biology) y sondas 16S panbacterianas personalizadas. Cabe destacar que la señal 16S bacteriana fue significativamente menor en el tejido cerebral normal adyacente al tumor en comparación con el tejido tumoral.
Para investigar la relación espacial del ARNr bacteriano con las firmas de proteínas y transcritos tumorales, calculamos la media geométrica de la señal bacteriana obtenida a partir de las sondas 16S y las regiones de interés (ROI) anotadas como 16S-bajo (primer cuartil) o 16S-alto (cuarto cuartil). El análisis de componentes principales (PCA) no supervisado de transcripciones humanas sugirió una agrupación distinta de las regiones de interés (ROI) tumorales con alto contenido de 16S en comparación con las ROI tumorales con bajo contenido de 16S. Para validar esto, utilizamos un modelo lineal mixto (LMM) para identificar transcripciones y proteínas con enriquecimiento diferencial en las regiones con alto contenido de 16S en comparación con las regiones con bajo contenido de 16S.
Tanto en las regiones tumorales con alto contenido de 16S de glioma como en las de BrM, identificamos proteínas y transcripciones vinculadas a la respuesta antimicrobiana. En el glioma, observamos un enriquecimiento proteico de moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP), incluyendo HMGB1 y HMGB2, que interactúan con receptores de reconocimiento de patrones (PRR), como los receptores tipo Toll (TLR)18. En BrM, las regiones 16S-high mostraron un enriquecimiento proteico de TLR9, un PRR clave para la detección de ácidos nucleicos microbianos intracelulares19,20, así como de la vía canónica descendente de TLR9, respaldada por la sobreexpresión de MyD88, miembros de la familia NF-κB comúnmente activados por TLR (RelA (también conocido como p65) y NF-κB2 (también conocido como p105/p50)) y factores reguladores del interferón (IRF)21, entre otros. La abundancia diferencial de transcripciones en las regiones 16S-high fue consistente con estas firmas proteicas, incluyendo transcripciones relacionadas con las vías TLR y NF-κB y otras transcripciones vinculadas a la respuesta a elementos microbianos intracelulares, como la familia TRIM22.
En las regiones tumorales BrM 16S-high, también observamos una sobre expresión de quimioatrayentes de neutrófilos, enzimas de neutrófilos y proteínas de presentación de antígenos. Para explorar más a fondo la composición celular dentro de las regiones 16S-high, realizamos tinción de inmunofluorescencia multiplex en secciones consecutivas de TMA utilizando paneles mieloides y linfoides, y observamos un enriquecimiento significativo de células CD16+CD56−GZMB−, que podrían representar neutrófilos.
Además de las firmas antimicrobianas, también observamos un enriquecimiento de proteínas de remodelación de la cromatina en el glioma, así como de proteínas y transcripciones del metabolismo lipídico y de respuesta al estrés celular, tanto en el glioma como en las regiones tumorales 16S-high de BrM.
Cabe destacar que las firmas antimicrobianas, inmunitarias y metabólicas asociadas con la señal intratumoral 16S no se relacionaron con un entorno inflamatorio generalizado, ya que no mostraron una correlación significativa con otras firmas de inflamación tumoral, incluyendo las vías IL-6 y STAT3, la actividad macrófaga y la inflamación crónica.
En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia de señales  antimicrobianas, inmunitarias y metabólicas asociadas con las regiones intratumorales 16S-high tanto en tumores BrM como en gliomas.

Las células tumorales 16S-positivas y sus alrededores presentan perfiles transcripcionales distintivos.
Primero, realizamos un análisis de expresión génica diferencial en muestras de individuos con glioma y BrM para identificar patrones transcripcionales intrínsecos tumorales compartidos, asociados con la señal 16S en cada tipo de tumor. En consonancia con los análisis DSP, identificamos transcripciones relacionadas con las respuestas antimicrobianas e inmunitarias, incluyendo PRR, miembros de la familia NF-κB y TRIM, y la señalización de interleucinas, así como transcripciones implicadas en el metabolismo lipídico, el estrés celular y la apoptosis/autofagia tanto en glioma como en BrM. En el glioma, las células 16S-positivas también mostraron una regulación positiva de las transcripciones relacionadas con la angiogénesis, potencialmente vinculada a firmas antimicrobianas e inmunitarias innatas23,24, junto con transcripciones asociadas con la remodelación de la cromatina, axonogénesis y neuroinflamación.
Para identificar patrones biológicos más amplios, realizamos un análisis de vías utilizando conjuntos de genes seleccionados derivados del Proceso Biológico de Ontología Génica (GOBP) y las anotaciones del Reactoma. Estos módulos personalizados reflejaron procesos clave destacados por DSP, incluyendo interacciones microorganismo-huésped, reclutamiento inmune, metabolismo lipídico, respuestas de estrés celular y angiogénesis. En BrM, las puntuaciones de la vía fueron significativamente más altas en las células tumorales 16S-positivas combinadas de los cuatro pacientes, lo que indica que las vías asociadas reflejan un programa transcripcional coordinado en lugar de cambios aislados a nivel de gen. A nivel de paciente individual, las puntuaciones de la vía fueron significativamente diferentes en al menos tres de cuatro pacientes, lo que sugiere una variabilidad interpaciente limitada en los patrones transcripcionales observados. En conjunto, estos hallazgos demuestran una capa de heterogeneidad de células tumorales en el TME de BrM que depende del contexto microbiano; sin embargo, el papel causal de los elementos microbianos en este entorno aún debe explorarse. La evaluación de estas vías predefinidas en células tumorales de glioma no produjo diferencias consistentes debido a la alta variabilidad interpaciente; Sin embargo, también se observó una sobreexpresión de otros conjuntos de genes relacionados con los procesos gliales y neuronales, lo que sugiere asociaciones específicas del tipo de tumor con las señales 16S.
A continuación, analizamos los perfiles transcripcionales compartidos de las vecindades de glioma y BrM dentro de un radio de 30 µm de células tumorales 16S-positivas (2-3 filas de células circundantes) en comparación con las vecindades 16S-negativas, incluyendo solo muestras con suficientes regiones elegibles. En consonancia con nuestros análisis regionales, las vecindades combinadas que rodean a las células 16S-positivas en muestras de glioma y BrM mostraron una sobreexpresión de las transcripciones implicadas en la señalización de citocinas y el reclutamiento inmunitario, así como de las transcripciones relacionadas con el metabolismo lipídico, el estrés celular y la angiogénesis. El análisis de vías en BrM demostró puntuaciones más altas en todas las vías predefinidas, tanto en el conjunto de datos combinado como en los pacientes individuales, excepto en el metabolismo lipídico en el paciente 41 (P41). Para evaluar si las vías identificadas en la BrM reflejan un estado inflamatorio general, examinamos las asociaciones con la señalización del interferón tipo II (IFN-II), IL-1, IL-6 e IL-10, la inflamación mieloide y la actividad de los linfocitos T. Ninguna de estas vías se enriqueció significativamente en las células tumorales 16S-positivas ni en sus alrededores. En el glioma, el análisis a nivel de vecindario no reveló un enriquecimiento consistente de las vías.
A pesar de las limitaciones derivadas del bajo número de células en este ensayo, identificamos perfiles transcripcionales y vías biológicas diferenciadas asociadas con la señal 16S a nivel celular y de vecindario en individuos con BrM y glioma, en consonancia con nuestro análisis DSP regional.

Las señales bacterianas intratumorales 16S se correlacionan con la microbiota oral e intestinal.
Dada la amplia literatura sobre el eje intestino-oral-cerebro25,26, nos propusimos determinar si las señales bacterianas intratumorales identificadas se asocian con el microbioma intestinal u oral relacionado. En nuestra cohorte prospectiva, se recogieron muestras coincidentes de heces (glioma n = 65, BrM n = 28), saliva (glioma n = 109, BrM n = 42) e hisopado bucal (glioma n = 112, BrM n = 42) en el momento de la craneotomía y se analizaron mediante secuenciación metagenómica shotgun. El microbioma intestinal y oral en individuos con glioma y BrM no mostró diferencias en la diversidad beta (índice de Bray-Curtis; heces, P = 0,45; saliva, P = 0,06; frotis bucal, P = 0,12), lo que sugiere que no existe correlación con el tipo de tumor cerebral. Posteriormente, comparamos los conjuntos de datos combinados de glioma y BrM con los datos de secuenciación metagenómica de individuos sanos del Proyecto del Microbioma Humano (HMP)27,28 (heces n = 209, n = 6, frotis bucal n = 160). La diversidad beta difirió significativamente entre los microbiomas asociados a tumores cerebrales y sanos (hisopado de heces y mejillas, P = 0,001; saliva, P = 0,014), e identificamos firmas bacterianas orales e intestinales distintas en individuos con tumor cerebral. Para controlar la edad, esta comparación se restringió a individuos con tumor cerebral de 18 a 40 años, en consonancia con la cohorte HMP; el sexo no fue un factor de confusión (hisopado de heces y mejillas, P > 0,9; saliva, P = 0,4). Encontramos que varios taxones bacterianos orales e intestinales asociados a tumores cerebrales se superponían con taxones bacterianos intratumorales, identificados con amplicón 16S o secuenciación metagenómica (Prevotella, Capnocytophaga, Streptococcus y Bifidobacterium), lo que sugiere una posible correlación entre la señal bacteriana intratumoral y la microbiota oral e intestinal. Cabe señalar que esta comparación puede verse limitada por las diferencias en las metodologías de recolección y secuenciación de muestras entre las cohortes de HMP y de tumores cerebrales.
Para evaluar más a fondo esta correlación, realizamos una secuenciación metagenómica shotgun en 34 muestras coincidentes de tumor y saliva (glioma n = 28, BrM n = 6) y 19 muestras coincidentes de tumor y heces (glioma n = 16, BrM n = 3) a una profundidad de secuenciación de 100 millones de lecturas por muestra. Para evitar la contaminación cruzada, las muestras de tumor, saliva y heces se procesaron y secuenciaron por separado. En 11 de los 34 pares de muestras de tumor y saliva, encontramos superposición entre la señal bacteriana del tumor y el microbioma salival, con un rango de entre una y tres especies por paciente, incluyendo Prevotella, Veillonella, Neisseria, Streptococcus y Bifidobacterium, entre otras. En promedio, el 79% de la longitud total de las secuencias detectadas en el tumor se superpuso con secuencias bacterianas salivales (rango de coincidencia de longitud porcentual: 20-100%; longitud promedio de la secuencia tumoral: 292 pb; rango: 149-835 pb).
En pares de muestras tumorales y heces, se detectó superposición de secuencias en uno de los 19 pares (Bifidobacterium; 50% de coincidencia de longitud; longitud de la secuencia tumoral: 302 pb). En promedio, el 53% del total de taxones identificados en los tumores se superpuso con taxones salivales o heces (rango: 16,6-100%). En general, estos hallazgos demuestran similitud de secuencias a nivel de especie entre la microbiota oral e intestinal y las señales bacterianas intratumorales.
Además de la microbiota comensal distante, las células tumorales diseminadas que migran desde el tumor primario al sitio metastásico pueden representar otra fuente potencial de señal bacteriana en BrM. Para evaluar esto, realizamos una secuenciación metagenómica shotgun en una cohorte retrospectiva de tumores primarios y de BrM emparejados (n = 8 pares, 50 % mujeres, edad 47-74 años). Tras la filtración, se detectaron taxones bacterianos en tres de ocho tumores primarios y en dos de ocho muestras de BrM; sin embargo, no se identificaron taxones superpuestos entre los pares emparejados.
A continuación, investigamos si la microbiota oral e intestinal se asocia con el pronóstico clínico en individuos con tumor cerebral. Distintas firmas bacterianas orales e intestinales se correlacionaron con la progresión intracraneal tras la resección. Específicamente, estas firmas orales e intestinales incluyeron taxones también detectados dentro del tumor, como Fusobacterium y Veillonella.
Este análisis se ajustó a los criterios clínicos con distribución desproporcionada. También evaluamos si la presencia o ausencia de la señal bacteriana 16S en tumores cerebrales se asociaba con parámetros clínicos.
Dentro de las limitaciones, esta cohorte clínicamente heterogénea, la señal intratumoral 16S no se correlacionó de forma independiente con las características del paciente o del tumor ni con el resultado clínico.

DISCUSIÓN

Los tumores cerebrales malignos, en particular el GBM y el BrM, siguen representando un desafío clínico con opciones de tratamiento limitadas1. En este estudio, identificamos señales bacterianas intracelulares de 16S como un componente del TME cerebral, si bien en un subconjunto de muestras tumorales y con baja abundancia. Nuestros hallazgos coinciden con informes recientes sobre ácidos nucleicos bacterianos en diversos tipos de cáncer, incluyendo GBM y metástasis del SNC4,7,15,16, y su distribución heterogénea dentro del TME7.
Si bien los estudios del microbioma se han basado históricamente en la secuenciación y los análisis computacionales, informes recientes han suscitado inquietud sobre la fiabilidad de estos enfoques estándar en muestras de baja abundancia, como el tejido tumoral11,12,13. Esta limitación técnica fue evidente en nuestros análisis de datos de amplicones 16S y secuenciación shotgun metagenómica, donde los esfuerzos de descontaminación no lograron eliminar todos los contaminantes conocidos. Se necesitan enfoques complementarios para evaluar la presencia microbiana en muestras con baja abundancia prevista. Esto se ejemplifica en varios estudios que utilizaron métodos específicos para teñir bacterias in situ4,7, recuperar bacterias cultivables de tumores colorrectales6,10 y melanoma9, y detectar actividad bacteriana en muestras de cáncer de mama4.
En el presente estudio, verificamos la presencia y distribución de elementos bacterianos intracelulares mediante FISH basado en ARN, tinción con LPS y SMI, y evaluamos su relevancia biológica en el TME cerebral mediante tecnologías espaciales. Cabe destacar que la FISH con ARNr 16S, que se ha correlacionado con el tamaño y la morfología bacteriana29, reveló señales que abarcaban desde pequeños puntos hasta estructuras del tamaño de una bacteria. Junto con la detección de LPS, estos hallazgos sugieren la posible presencia de bacterias tanto intactas como fragmentadas.
Nuestros intentos de cultivar bacterias a partir de muestras de tumores cerebrales no produjeron colonias bacterianas, lo que probablemente refleja las dificultades técnicas de cultivar bacterias de baja abundancia y distribución heterogénea a partir de muestras de tejido, o las variaciones fenotípicas de bacterias intratumorales en entornos complejos que pueden dejarlas latentes e incultivables30.
Sin embargo, la evidencia sigue siendo insuficiente para concluir la presencia de una microbiota diversa y activa en los tumores cerebrales. Estos hallazgos subrayan que la naturaleza y la función de los elementos bacterianos dentro del TME pueden variar según el tipo de tumor y la ubicación anatómica, desde una microbiota diversa en algunos hasta una baja abundancia de elementos bacterianos en otros.
La distribución intracelular de elementos bacterianos observada en nuestro estudio coincide con informes previos en cánceres de células escamosas colorrectales y orales6,7. Los taxones bacterianos intratumorales que identificamos fueron predominantemente anaerobios intracelulares gramnegativos (por ejemplo, Prevotella, Fusobacterium y Capnocytophaga), así como taxones intracelulares facultativos (por ejemplo, Neisseria) y extracelulares (por ejemplo, Gemella). Más allá de la internalización o invasión directa, los elementos bacterianos de taxones intracelulares y extracelulares también pueden ingresar a células no fagocíticas a través de vesículas extracelulares bacterianas, que pueden transportar diversas moléculas biológicamente activas, como proteínas, LPS o ácido lipoteicoico y ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN pequeños y ADN)31.
Una vez internalizadas, las bacterias o sus vesículas extracelulares pueden modular las respuestas del huésped, como promover la señalización proinflamatoria (por ejemplo, mediante la activación de NF-κB) y la evasión inmunitaria7,32,33. Aprovechando las tecnologías espaciales, descubrimos que las señales bacterianas intratumorales se asociaban con características antimicrobianas, inmunitarias y metabólicas a nivel celular, vecinal y regional del TME. En el BrM, específicamente, se enriquecieron los componentes de la vía TLR9 y NF-κB (una respuesta inmunitaria innata a los ácidos nucleicos microbianos intracelulares19). Además, las señales intratumorales de 16S se correlacionaron con una mayor presencia y actividad de neutrófilos, en consonancia con hallazgos previos en el cáncer colorrectal7. Curiosamente, las regiones ricas en 16S en el glioma, pero no la BrM, mostraron una regulación positiva de las proteínas de remodelación de la cromatina, lo que sugiere respuestas diferenciadas del huésped a las señales bacterianas en tumores cerebrales primarios y metastásicos.
En conjunto, estos datos sugieren un posible papel biológico de las señales intratumorales de 16S en el TME cerebral. Sin embargo, debido al diseño clínico de este estudio, no se puede establecer una causalidad.
Nuestros hallazgos sientan las bases para futuros estudios mecanísticos que determinen las consecuencias funcionales de las señales bacterianas intratumorales.
El origen de los elementos microbianos asociados a tumores, en particular en tumores anatómicamente distantes de la microbiota intestinal, sigue siendo en gran parte desconocido. Se han propuesto diversos mecanismos para la transferencia de microorganismos y elementos microbianos al EMT, incluyendo la colonización por comensales locales, la diseminación hematógena, la translocación mediada por tumores y células inmunitarias, y las vesículas extracelulares bacterianas6,10,34,35.
En este estudio, demostramos que las señales intratumorales 16S se superponen con la microbiota oral e intestinal a nivel de taxones y secuencias. Curiosamente, se han detectado ácidos nucleicos y proteasas bacterianas orales, así como péptidos bacterianos intestinales, en los cerebros de individuos con enfermedades neurodegenerativas y tumores cerebrales primarios16,36. Estos hallazgos sugieren una posible superposición mecanística en la contribución de microorganismos distantes a ambas patologías. Cabe destacar que en este estudio se observó que un mayor número de taxones de bacterias orales, en comparación con las bacterias intestinales, se superponían con la señal bacteriana intratumoral, lo que podría reflejar la proximidad anatómica entre la cavidad oral y el cerebro, así como la existencia de ganglios linfáticos de drenaje compartidos37,38. Además, se ha sugerido la vía olfativa como una posible vía para la transferencia de microorganismos orales al cerebro en la enfermedad de Alzheimer39. No obstante, nuestro estudio también reveló evidencia de translocación bacteriana intestinal-oral, con un enriquecimiento de taxones orales en la microbiota intestinal de individuos con tumor cerebral, y viceversa. Este intercambio bidireccional, descrito previamente en diferentes patologías, incluido el cáncer40,41, podría ser la causa de las superposiciones de secuencias observadas.
Otro posible mecanismo, en particular en los tumores BrM, es la transferencia de material genético bacteriano a través de células tumorales metastásicas circulantes e inmunitarias, como se ha descrito previamente en metástasis hepáticas de cáncer colorrectal6. En una cohorte retrospectiva de tumores BrM y primarios emparejados, no se encontró correlación entre las señales bacterianas intratumorales en los BrM y sus correspondientes primarios. Aunque limitado por el pequeño tamaño de la muestra, este hallazgo sugiere que la diseminación de células tumorales podría no ser la vía predominante de transferencia de señales bacterianas. La presencia de señales bacterianas en tumores cerebrales no metastásicos y su distribución a través de las células estromales residentes en el cerebro respaldan aún más esta idea. No obstante, varios taxones bacterianos identificados aquí (por ejemplo, Fusobacterium nucleatum) también se han encontrado en otros tumores primarios sólidos, lo que subraya la necesidad de estudios mecanísticos que utilicen el rastreo bacteriano para evaluar rigurosamente estas relaciones. En conjunto, nuestros hallazgos resaltan una interacción compleja entre los elementos bacterianos intratumorales, el TME cerebral y las comunidades microbianas distantes.

LIMITACIONES DEL ESTUDIO

Derivan principalmente del entorno clínico y la naturaleza correlacional de los análisis, así como del modesto tamaño de la muestra con respecto a la heterogeneidad de la cohorte, lo que dificulta nuestra capacidad para evaluar exhaustivamente la importancia biológica y clínica de las señales bacterianas intratumorales.
Los conocimientos adquiridos en este proyecto pueden orientar estudios futuros para abordar importantes lagunas en el campo, como la determinación de los mecanismos que impulsan la transferencia de la señal 16S a los tumores cerebrales, su papel causal en la conformación del TME y su impacto en la progresión de los tumores cerebrales.
Por último, la composición de la microbiota puede verse considerablemente afectada por factores geográficos, ambientales y de estilo de vida42,43. Por lo tanto, discernir la universalidad de los taxones bacterianos vinculados a los tumores cerebrales, ya sean intratumorales o a distancia, y su impacto clínico individual y colectivo, requerirá investigaciones multiinstitucionales estandarizadas en diversas poblaciones y ubicaciones geográficas. Abogamos por la colaboración en el campo para lograr estos objetivos.

NOTA: Este es un resumen extenso, bastante completo y detallado del artículo. Las tablas, gráficos, figuras y una bibliografía completa se pueden encontrar en la publicación mencionada al principio.

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