Editoriales

Buenos Aires 01 de Enero del 2026

ROMPIENDO LA RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS

 

 

Rompiendo la Resistencia a Los Antimicrobianos

 

Christopher, D. Furniss, Nikol Kaderabkova, Declan Barker, Patricia Bernal, Eugenia Maslova,
Amanda Antwi, Helen McNeil, Hannah Pugh, Laurent Dortet, Despoina A. Mavridou et al
                                   * MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Department of Life Sciences, Imperial College London, United Kingdom; 
                                   * Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin, United States; 
                                   * Department of Microbiology, Faculty of Biology, Universidad de Sevilla, Spain;
                                   * Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences, Brunel University London, United Kingdom; 
                                   * Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, United Kingdom; 
                                   * Department of Bacteriology-Hygiene, Bicêtre Hospital, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris, France; 
                                   * “Structure, Function and Expression of Broad-spectrum β-lactamases", Paris-Sud University, LabEx Lermit, Faculty of Medicine, France; 
                                   * French National Reference Centre for Antibiotic Resistance, France; 
                                   * Laboratoire de Microbiologie, Institut de Biologie, Université de Neuchâtel, Switzerland 

 eLife (Jan 2022) – https://doi.org/10.7554/eLife.57974

 


La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una de las preocupaciones de salud pública más importantes de nuestro tiempo (Rochford et al., 2018).
Con la escasez de nuevos antibióticos en desarrollo farmacéutico y la continua aparición de cepas bacterianas multirresistentes, es más importante que nunca desarrollar nuevas estrategias antibacterianas y encontrar alternativas para combatir la resistencia. La OMS considera crucial el desarrollo de nuevos tratamientos para bacterias gramnegativas
(Tacconelli et al., 2018), identificar nuevos enfoques para combatir estos organismos resulta particularmente difícil debido a su singular barrera de permeabilidad de doble membrana y la amplia gama de determinantes de RAM que producen. Por esta razón, en lugar de centrarse en los procesos citoplasmáticos, se buscan cada vez más estrategias antimicrobianas que inhiban los componentes de la envoltura celular o afecten la actividad de los determinantes de resistencia (Hart et al., 2019; Laws et al., 2019; Luther et al., 2019; Nicolas et al., 2019; Srinivas et al., 2010).
La envoltura celular de las bacterias gramnegativas alberga numerosos determinantes de resistencia a los antimicrobianos (RAM), y las enzimas β-lactamasas representan actualmente un problema aparentemente insalvable.
Hasta la fecha, se han identificado más de 6500 enzimas únicas capaces de degradar compuestos β-lactámicos. A pesar del desarrollo de antibióticos β-lactámicos más avanzados, como los carbapenémicos y los monobactámicos, la resistencia ha seguido surgiendo gracias a la evolución de muchas β-lactamasas de acción amplia (Bush, 2018).
Esta constante aparición de resistencia no solo amenaza a los β-lactámicos, los antibióticos más recetados a nivel mundial (Meletis, 2016; Versporten et al., 2018), sino que también aumenta el uso de agentes de último recurso, como la colistina, un antibiótico polimixino, para el tratamiento de infecciones multirresistentes (Li et al., 2006). Como resultado, la resistencia a la colistina está en aumento, debido en parte a la alarmante proliferación de nuevos determinantes de resistencia a la colistina en la envoltura celular. Estas proteínas, llamadas enzimas móviles de resistencia a la colistina (MCR), representan el único mecanismo movilizable de resistencia a la polimixina descrito hasta la fecha (Poirel et al., 2017). Desde su descubrimiento en 2015, se han identificado 10 familias de proteínas MCR, y estas enzimas se están convirtiendo rápidamente en una importante amenaza para la longevidad de la colistina (Sun et al., 2018). Junto con las β-lactamasas y las enzimas MCR, las bombas de eflujo de Resistencia-Nodulación-División (RND) enriquecen aún más el repertorio de determinantes de RAM en la envoltura celular. Estos conjuntos multiproteicos abarcan el periplasma y eliminan numerosos antibióticos (Blair et al., 2014; Cox y Wright, 2013), lo que hace que las bacterias gramnegativas sean inherentemente resistentes a importantes antimicrobianos. La inhibición de los determinantes de la RAM se ha logrado tradicionalmente mediante el desarrollo de adyuvantes antibióticos. Estas moléculas alteran la función de las proteínas de resistencia y se utilizan en combinación con los antibióticos existentes para eliminar infecciones complejas (Laws et al., 2019). Si bien este enfoque ha demostrado ser eficaz y ha dado lugar al desarrollo de varios inhibidores de β-lactamasa de uso clínico (Laws et al., 2019), hasta la fecha no ha logrado incapacitar simultáneamente diferentes clases de determinantes de la RAM. Esto se debe a que los adyuvantes antibióticos tradicionales se unen al sitio activo de una enzima de resistencia y, por lo tanto, solo son eficaces contra familias de proteínas específicas. Para interrumpir la RAM de forma más amplia, es necesario desarrollar nuevas estrategias que se centren en la biogénesis o la estabilidad, en lugar de la actividad, de los determinantes de resistencia.
De esta manera, se puede inhibir la formación de múltiples proteínas de resistencia a la vez, en lugar de desarrollar compuestos específicos que inactivan enzimas RAM individuales una vez que ya están activas. En entornos extracitoplasmáticos, la estabilidad de las proteínas a menudo depende de la formación de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína (Goemans.,2014;Heras et al., 2007).
En particular, en la envoltura celular de las bacterias Gram-negativas este proceso es realizado por una sola vía, el sistema DSB, y más específicamente por una sola proteína, la tiol oxidasa DsbA (Bardwell et al., 1991; Denoncin y Collet, 2013; Hiniker y Bardwell, 2004; Kadokura et al., 2004; Martin et al., 1993). Se ha demostrado que la DsbA ayuda al plegamiento de cientos de proteínas en el periplasma. Como tal, la inhibición de las proteínas DSB se ha propuesto como una estrategia prometedora de amplia acción para atacar la patogénesis bacteriana sin perjudicar la viabilidad bacteriana (Denoncin y Collet, 2013; Heras et al., 2009; Landeta et al., 2018; Heras et al., 2015). No obstante, la contribución del plegamiento de proteínas oxidativas a la RAM nunca ha sido examinada. Dado que varios determinantes de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) de la envoltura celular contienen múltiples cisteínas (Bardwell et al., 1991; Piek et al., 2014), planteamos la hipótesis de que interferir con la función de DsbA no solo comprometería la virulencia bacteriana (Heras et al., 2015), sino que también podría ofrecer un enfoque amplio para romper la resistencia a través de diferentes mecanismos al afectar la estabilidad de las proteínas de resistencia. En este trabajo, probamos esta hipótesis investigando la contribución de la formación de enlaces disulfuro a tres de los mecanismos de resistencia más importantes en la envoltura celular de Enterobacteria: la degradación de antibióticos β-lactámicos por β-lactamasas, la resistencia a la polimixina derivada de la producción de enzimas MCR y la resistencia intrínseca a múltiples clases de antibióticos debido a las bombas de eflujo RND.
Encontramos que algunos de estos mecanismos de resistencia dependen de DsbA y demostramos que cuando la actividad de DsbA se inhibe químicamente, se puede anular la resistencia de varias enzimas clínicamente importantes. Nuestros hallazgos demuestran que la homeostasis proteica en la envoltura celular permite la alteración de diversas proteínas de resistencia a los antimicrobianos (RAM) y, por lo tanto, podría ser una vía prometedora para el desarrollo de enfoques terapéuticos de nueva generación.
La actividad de múltiples proteínas de resistencia de la envoltura celular depende de DsbA. Se ha demostrado que DsbA facilita el plegamiento de numerosas proteínas periplásmicas y expuestas a la superficie en bacterias gramnegativas. Dado que muchos determinantes de RAM también transitan por el periplasma, postulamos que la inactivación del sistema DSB podría afectar su plegamiento y, por lo tanto, perjudicar su función. Para comprobarlo, nos centramos primero en las proteínas de resistencia presentes en la envoltura celular que contienen dos o más residuos de cisteína, ya que su estabilidad y plegamiento pueden depender de la formación de enlaces disulfuro (Piek et al., 2014).
Seleccionamos un panel de 12 β-lactamasas clínicamente importantes de diferentes clases de Ambler (clases A, B y D), la mayoría de las cuales están codificadas en plásmidos. Las enzimas seleccionadas representan diferentes estructuras proteicas, pertenecen a familias filogenéticas discretas y presentan actividades hidrolíticas diferenciadas, que abarcan desde la degradación de penicilinas y cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación (β-lactamasas de espectro extendido, BLEE) hasta la inactivación de β-lactámicos de último recurso (carbapenemasas). Además de las β-lactamasas, seleccionamos cinco fosfoetanolamina transferasas representativas de toda la filogenia MCR para obtener una visión general completa de la contribución de DsbA a la actividad de estos determinantes de resistencia a la colistina.
Expresamos nuestro panel de 17 enzimas de resistencia discretas en una cepa de Escherichia coli K-12 (E. coli MC1000) y su mutante isogénico dsbA (E. coli MC1000 dsbA) y registramos los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) para antibióticos β-lactámicos o polimixinas, según correspondiera.
Descubrimos que la ausencia de DsbA resultó en una disminución sustancial en los valores de MIC (> 2 veces el valor de corte) para todas las β-lactamasas analizadas,excepto una.Para la β-lactamasa que parecía no verse afectada por la ausencia de DsbA, SHV-27, realizamos el mismo experimento en condiciones de estrés térmico (a 43 °C en lugar de 37 °C). En estas condiciones, la falta de DsbA también provocó una notable caída del valor de la CMI de la cefuroxima. Se ha descrito un efecto similar para TEM-1, en el que su enlace disulfuro se vuelve importante para la función enzimática en condiciones de estrés (estrés por temperatura o pH) (Schultz et al., 1987). Como SHV-27 tiene el espectro hidrolítico más estrecho de todas las enzimas analizadas, este resultado sugiere que podría existir una correlación entre el espectro hidrolítico de la β-lactamasa y su dependencia de DsbA para conferir resistencia. En el caso de las CMI de la colistina, no implementamos un valor de corte > 2 veces para las disminuciones observadas en los valores de la CMI como hicimos para las cepas que expresan β-lactamasas. Los antibióticos de polimixina tienen una ventana terapéutica muy estrecha y existe una superposición significativa entre las concentraciones plasmáticas terapéuticas y tóxicas de colistina (Nation et al., 2016; Plachouras et al., 2009).
Dado que los pacientes que dependen del tratamiento con colistina suelen estar gravemente enfermos, presentan múltiples comorbilidades y un alto riesgo de lesión renal aguda debido a la toxicidad de la colistina, cualquier reducción en la dosis de colistina necesaria para lograr la actividad terapéutica se considera valiosa (Nation et al., 2019). La expresión de enzimas MCR en nuestra cepa silvestre de E. coli K-12 resultó en resistencia a la colistina (CMI de 3 μg/mL o superior), mientras que la cepa que albergaba el vector vacío fue sensible a la colistina (CMI de 1 μg/mL). En casi todos los casos analizados, la ausencia de DsbA provocó una resensibilización de las cepas, según lo definido por el punto de corte EUCAST (las cepas de E. coli con una CMI de 2 μg/mL o inferior se clasifican como susceptibles; Figura 1C), lo que indica que DsbA es importante para la función de MCR. Considerando las dificultades del uso terapéutico de colistina (Nation et al., 2016; Plachouras et al., 2009; Nation et al., 2019), concluimos que la eliminación de dsbA provoca disminuciones clínicamente significativas en los valores de CMI de colistina para las enzimas MCR analizadas y que se debe investigar más a fondo el papel de DsbA en la función de MCR.
Los valores de CMI de tipo silvestre pudieron restablecerse para todas las enzimas que contienen cisteína analizadas mediante la complementación de dsbA. Además, dado que DsbA actúa sobre sus sustratos postraduccionalmente, realizamos una serie de experimentos de control diseñados para evaluar si los efectos registrados eran específicos de la interacción de las proteínas de resistencia con DsbA, y no el resultado de una incapacidad general de la cepa mutante dsbA para resistir el estrés antibiótico. No observamos disminuciones en los valores de MIC para el antibiótico aminoglucósido gentamicina, que no se ve afectado por la actividad de las enzimas probadas. Además, los valores de MIC de β-lactama de las cepas que albergan el vector vacío solo, o un plásmido que codifica L2-1, una β-lactamasa que contiene tres residuos de cisteína, pero ningún enlace disulfuro (PDB ID: 1O7E), se mantuvieron sin cambios. Finalmente, para descartar la posibilidad de que la deleción de dsbA causara cambios en la integridad de la envoltura celular que pudieran confundir nuestros resultados, medimos la permeabilidad de la membrana externa e interna del mutante dsbA. Para evaluar la permeabilidad de la membrana externa, utilizamos el colorante fluorescente 1-N-fenilnaftilamina (NPN) y complementamos nuestros resultados con ensayos de CMI de vancomicina. Para evaluar la integridad de toda la envoltura celular, utilizamos el colorante fluorescente yoduro de propidio (PI), así como el sustrato de la β-galactosidasa, rojo de clorofenilo-β-D-galactopiranósido (CPRG). Los cuatro ensayos confirmaron que la integridad de la envoltura celular del mutante dsbA es comparable a la de la cepa parental.
Todos estos resultados indican que muchos determinantes de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) de la envoltura celular que contienen más de un residuo de cisteína son sustratos de DsbA y que el proceso de formación de enlaces disulfuro es importante para su actividad.
A diferencia de las β-lactamasas y las enzimas MCR, ninguno de los componentes de las seis bombas de eflujo RND de E. coli contiene residuos de cisteína periplásmica (Wang et al., 2017) y, por lo tanto, no son sustratos del sistema DSB. No obstante, dado que DsbA facilita el plegamiento de aproximadamente 300 proteínas extracitoplasmáticas y desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del proteoma de la envoltura celular (Kadokura et al., 2004; Dutton et al., 2008; Vertommen et al., 2008), quisimos evaluar si los cambios en la proteostasis periplásmica que ocurren en su ausencia podrían influir indirectamente en la función de la bomba de eflujo. Para ello, determinamos los valores de CMI de tres antibióticos que son sustratos de la bomba de eflujo RND utilizando E. coli MG1655, una cepa modelo para estudios de eflujo, su mutante dsbA y un mutante que carece de acrA, un componente esencial de la principal bomba RND de E. coli AcrAB-TolC. Los valores de CMI para el mutante dsbA fueron inferiores a los de la cepa parental para todos los antibióticos sustrato probados, pero se mantuvieron sin cambios para la gentamicina sin sustrato. Esto indica que la cepa MG1655 dsbA generalmente puede resistir el estrés antibiótico tan eficientemente como su progenitora, y que las disminuciones registradas en los valores de CMI son específicas de la función de la bomba de eflujo en ausencia de DsbA. Como se esperaba para una deleción génica de un componente de la bomba, el mutante acrA tuvo valores de CMI sustancialmente inferiores para los antibióticos efluidos. Al mismo tiempo, aunque la gentamicina no es efluida por AcrAB-TolC (Nikaido, 1996), la CMI de gentamicina del mutante acrA fue dos veces menor que la de E. coli MG1655, de acuerdo con el hecho de que una de las bombas RND menores en E. coli, la bomba de aminoglucósidos AcrD, depende completamente de AcrA para su función (Aires y Nikaido, 2005; Rosenberg et al., 2000; Yamasaki et al., 2011). Como antes, el fenotipo observado pudo revertirse mediante la complementación de dsbA (Figura 1—figura suplementaria 8) y los efectos registrados no se debieron a cambios en la permeabilidad de la membrana.
El cloranfenicol es el único antibiótico de los sustratos de la bomba de eflujo analizados que presenta un punto de corte EUCAST para bacterias gramnegativas (las cepas de E. coli con una CMI de 8 μg/mL o inferior se clasifican como sensibles). Cabe destacar que la disminución de la CMI para este sustrato de la bomba, causada por la deleción de dsbA, sensibilizó a la cepa de E. coli MG1655 dsbA al cloranfenicol.
En general, el efecto de la ausencia de DsbA en la eficiencia de la bomba de eflujo es modesto y mucho menos sustancial que el medido para un mutante sin acrA (disminución de la CMI de 2 a 3 veces frente a una disminución de 5 a 16 veces, respectivamente). No obstante, las disminuciones registradas en los valores de CMI son robustas y concuerdan con estudios previos que indican que la eliminación de dsbA aumenta la sensibilidad de E. coli a colorantes como el naranja de acridina y la pironina Y, sustratos conocidos de AcrAB-TolC. Si bien es improbable que las disminuciones en los valores de CMI para los antibióticos efluidos en ausencia de DsbA tengan relevancia clínica, resulta interesante explorar más a fondo la relación mecanística entre DsbA y las bombas de eflujo, ya que existen muy pocos ejemplos de DsbA importante para la función de las proteínas extracitoplasmáticas, independientemente de su capacidad para formar enlaces disulfuro (Alonso-Caballero et al., 2018; Zheng et al., 1997).

DISCUSIÓN

Este trabajo es uno de los primeros informes de una estrategia capaz de inhibir simultáneamente múltiples tipos de determinantes de la RAM al comprometer la función de una única diana. Al inhibir DsbA, una proteína no esencial de la envoltura celular exclusiva de las bacterias, podemos inactivar diversas enzimas de resistencia y sensibilizar a patógenos cruciales a varios antibióticos existentes. Se espera que esta prueba de principio incentive aún más el desarrollo de inhibidores de DsbA y abra nuevas vías para el desarrollo de nuevos adyuvantes que ayuden a revertir la RAM en organismos gramnegativos.
Demostramos que la inhibición de DsbA incapacita a las β-lactamasas de amplio espectro de tres de las cuatro clases de Ambler (clases A, B y D). Esto incluye enzimas que no son susceptibles a los inhibidores clásicos de β-lactamasas, como los miembros de las familias KPC y OXA, así como metalo-β-lactamasas como L1-1 del organismo a menudo panresistente Stenotrophomonas maltophilia.
La función de estas proteínas se ve afectada sin una pequeña molécula que se una a su sitio activo, a diferencia de la mayoría de los inhibidores de β-lactamasas utilizados actualmente, que a menudo generan resistencia (Laws et al., 2019). Dado que la dependencia de DsbA se conserva dentro de los grupos filogenéticos (Figura 1—figura suplementaria 2), con base en el número de enzimas que pertenecen a la misma familia filogenética que las β-lactamasas analizadas en este estudio, anticipamos que un total de 195 enzimas discretas dependen de DsbA para su estabilidad y función, 84 de las cuales no pueden ser inhibidas por enfoques adyuvantes clásicos. La DsbA está ampliamente conservada (Heras et al., 2009), por lo que actuar sobre el sistema DSB no solo debería comprometer las β-lactamasas en Enterobacteria, sino que, como demuestran nuestros experimentos con aislados clínicos de P. aeruginosa (Figura 8), también podría ser una vía prometedora para alterar la función de los determinantes de resistencia a los antimicrobianos (RAM) expresados ​​por otros organismos gramnegativos altamente resistentes. Por lo tanto, junto con el hecho de que aproximadamente el 56 % de las familias filogenéticas de β-lactamasas presentes en patógenos y organismos capaces de causar infecciones oportunistas contienen enzimas con dos o más cisteínas, prevemos que muchas más β-lactamasas clínicamente relevantes, además de las ya analizadas en este estudio, dependan de la DsbA.
Las enzimas MCR se están convirtiendo rápidamente en una grave amenaza para el uso de colistina (Sun et al., 2018), un fármaco de último recurso a menudo necesario para el tratamiento de infecciones multirresistentes (Li et al., 2006). Actualmente, los inhibidores experimentales de estas proteínas son escasos y están mal caracterizados (Zhou et al., 2019), y solo un compuesto existente, el fármaco antirreumático auranofina, parece afectar con éxito a las enzimas MCR, a través del desplazamiento de su cofactor de zinc (Sun et al., 2020). Como todos los miembros de MCR contienen múltiples enlaces disulfuro, la inhibición del sistema DSB proporciona una solución ampliamente aplicable para revertir la resistencia a la colistina mediada por MCR (Figuras 1C, 5E y 7ABC) que probablemente se extendería a nuevas proteínas MCR que puedan surgir en el futuro. Dado que la disminución en los valores de MIC de colistina tras la deleción de dsbA o la inhibición de DsbB es modesta, este fenotipo no puede utilizarse en futuras pruebas destinadas a identificar inhibidores de DsbA, porque dichas aplicaciones requieren una disminución mayor a 4 veces en los valores de MIC registrados para identificar de forma fiable compuestos líderes prometedores. No obstante, nuestros hallazgos en este estudio demuestran claramente que la ausencia de DsbA provoca la degradación de las enzimas MCR y la abolición de su función (Figura 3), lo que, a su vez, provoca la sensibilización a la colistina de todos los aislados clínicos de E. coli analizados.
Esto se suma a otros esfuerzos para reducir la CMI de colistina en cepas resistentes a la polimixina (Minrovic et al., 2019). Por lo tanto, si se dispusiera de un inhibidor de DsbA clínicamente útil, sería valioso probar su eficacia contra grandes paneles de cepas clínicas que expresan MCR, ya que podría ofrecer una nueva vía para eludir la resistencia a la colistina mediada por MCR.
Hasta la fecha, no se han identificado inhibidores de la bomba de eflujo con aplicación clínica (Sharma et al., 2019), a pesar de los numerosos esfuerzos por actuar sobre estos conjuntos macromoleculares para superar la resistencia intrínseca. Si bien la eliminación de dsbA sensibiliza la cepa de E. coli analizada al cloranfenicol, los efectos generales de la ausencia de DsbA sobre la función de eflujo son, en el mejor de los casos, modestos. Dicho esto, nuestra investigación sobre la relación entre la proteostasis mediada por DsbA y la función de la bomba destaca la importancia de otras proteínas de la envoltura celular responsables de la homeostasis proteica, como DegP, para el eflujo bacteriano. Dado que la envoltura celular contiene múltiples catalizadores de plegamiento de proteínas (Goemans et al., 2014), sería conveniente evaluar si otras proteínas redox, chaperonas o proteasas podrían actuar para comprometer indirectamente las bombas de eflujo.
En términos más generales, nuestros hallazgos demuestran que las vías de proteostasis de la envoltura celular tienen un potencial significativo, aún sin explotar, para el desarrollo de nuevas estrategias antibacterianas. El ejemplo del sistema DSB presentado aquí es particularmente revelador. Esta vía, inicialmente considerada simplemente como un sistema de mantenimiento (Kadokura et al., 2003), desempeña un papel fundamental en la adaptación al nicho bacteriano clínicamente relevante. Además de asistir en el plegamiento del 40% del proteoma de la envoltura celular (Dutton et al., 2008; Vertommen et al., 2008), el sistema DSB es esencial para la virulencia (Heras et al., 2009; Landeta et al., 2018), desempeña un papel clave en la formación y activación de células persistentes bacterianas (Wilmaerts et al., 2019) y, como se observa en este trabajo, es necesario para la supervivencia bacteriana en presencia de compuestos antibióticos ampliamente utilizados. Como se muestra en nuestros experimentos in vivo, la focalización de dicho sistema en patógenos gramnegativos podría conducir a enfoques adyuvantes que inactiven los determinantes de RAM a la vez que incapacitan un arsenal de factores de virulencia. Por lo tanto, este estudio no solo sienta las bases para futuras aplicaciones clínicas, como el desarrollo de adyuvantes antibióticos de amplia acción, sino que también sirve como paradigma para explotar otros procesos accesibles de proteostasis de la envoltura celular para el diseño de terapias de nueva generación.
Este trabajo es uno de los primeros informes de una estrategia capaz de alterar simultáneamente múltiples tipos de determinantes de la RAM al comprometer la función de una única diana. Al inhibir DsbA, una proteína no esencial de la envoltura celular exclusiva de las bacterias, podemos inactivar diversas enzimas de resistencia y sensibilizar a patógenos cruciales a varios antibióticos existentes. Se espera que esta prueba de principio incentive aún más el desarrollo de inhibidores de DsbA y abra nuevas vías para la creación de nuevos adyuvantes que ayuden a revertir la RAM en organismos gramnegativos.
Hemos demostrado que la inhibición de DsbA incapacita a las β-lactamasas de amplio espectro de tres de las cuatro clases de Ambler (clases A, B y D). Esto incluye enzimas que no son susceptibles a los inhibidores clásicos de β-lactamasa, como los miembros de las familias KPC y OXA, así como metalo-β-lactamasas como L1-1 del organismo a menudo panresistente Stenotrophomonas maltophilia. La función de estas proteínas se ve afectada sin una pequeña molécula que se una a su sitio activo, a diferencia de la mayoría de los inhibidores de β-lactamasas utilizados actualmente, que suelen generar resistencia (Laws et al., 2019). Dado que la dependencia de DsbA se conserva dentro de los grupos filogenéticos (Figura 1—figura suplementaria 2), con base en el número de enzimas que pertenecen a la misma familia filogenética que las β-lactamasas analizadas en este estudio, prevemos que un total de 195 enzimas discretas dependen de DsbA para su estabilidad y función, 84 de las cuales no pueden inhibirse mediante métodos adyuvantes clásicos. La DsbA está ampliamente conservada (Heras et al., 2009), por lo que actuar sobre el sistema DSB no solo debería comprometer las β-lactamasas en Enterobacteria, sino que, como demuestran nuestros experimentos con aislados clínicos de P. aeruginosa (Figura 8), también podría ser una vía prometedora para alterar la función de los determinantes de resistencia a los antimicrobianos (RAM) expresados ​​por otros organismos gramnegativos altamente resistentes.
Por lo tanto, junto con el hecho de que aproximadamente el 56 % de las familias filogenéticas de β-lactamasas presentes en patógenos y organismos capaces de causar infecciones oportunistas contienen enzimas con dos o más cisteínas, prevemos que muchas más β-lactamasas clínicamente relevantes, además de las ya analizadas en este estudio, dependan de la DsbA.
Las enzimas MCR se están convirtiendo rápidamente en una grave amenaza para el uso de colistina (Sun et al., 2018), un fármaco de último recurso a menudo necesario para el tratamiento de infecciones multirresistentes (Li et al., 2006). Actualmente, los inhibidores experimentales de estas proteínas son escasos y están mal caracterizados (Zhou et al., 2019), y solo un compuesto existente, el fármaco antirreumático auranofina, parece afectar con éxito a las enzimas MCR, a través del desplazamiento de su cofactor de zinc (Sun et al., 2020). Como todos los miembros de MCR contienen múltiples enlaces disulfuro, la inhibición del sistema DSB proporciona una solución ampliamente aplicable para revertir la resistencia a la colistina mediada por MCR (Figuras 1C, 5E y 7ABC) que probablemente se extendería a nuevas proteínas MCR que puedan surgir en el futuro. Dado que la disminución en los valores de MIC de colistina tras la deleción de dsbA o la inhibición de DsbB es modesta, este fenotipo no puede utilizarse en futuras pruebas destinadas a identificar inhibidores de DsbA, porque dichas aplicaciones requieren una disminución mayor a 4 veces en los valores de MIC registrados para identificar de forma fiable compuestos líderes prometedores.
No obstante, nuestros hallazgos en este estudio demuestran claramente que la ausencia de DsbA provoca la degradación de las enzimas MCR y la abolición de su función, lo que, a su vez, provoca la sensibilización a la colistina de todos los aislados clínicos de E. coli analizados. Esto se suma a otros esfuerzos dirigidos a reducir la CMI de colistina en cepas resistentes a la polimixina (Minrovic et al., 2019; Zimmerman et al., 2020). Por lo tanto, si se dispusiera de un inhibidor de DsbA clínicamente útil, sería valioso probar su eficacia contra grandes paneles de cepas clínicas que expresan MCR, ya que podría ofrecer una nueva vía para eludir la resistencia a la colistina mediada por MCR.
Hasta la fecha, no se han identificado inhibidores de la bomba de eflujo con aplicación clínica (Sharma et al., 2019), a pesar de los numerosos esfuerzos por actuar sobre estos conjuntos macromoleculares para superar la resistencia intrínseca. Si bien la eliminación de dsbA sensibiliza la cepa de E. coli analizada al cloranfenicol, los efectos generales de la ausencia de DsbA sobre la función de eflujo son, en el mejor de los casos, modestos. Dicho esto, nuestra investigación sobre la relación entre la proteostasis mediada por DsbA y la función de la bomba destaca la importancia de otras proteínas de la envoltura celular responsables de la homeostasis proteica, como DegP, para el eflujo bacteriano. Dado que la envoltura celular contiene múltiples catalizadores de plegamiento de proteínas (Goemans et al., 2014), sería conveniente evaluar si otras proteínas redox, chaperonas o proteasas podrían actuar para comprometer indirectamente las bombas de eflujo.
En términos más generales, nuestros hallazgos demuestran que las vías de proteostasis de la envoltura celular tienen un potencial significativo, aún sin explotar, para el desarrollo de nuevas estrategias antibacterianas. El ejemplo del sistema DSB presentado aquí es particularmente revelador. Esta vía, inicialmente considerada simplemente como un sistema de mantenimiento (Kadokura et al., 2003), desempeña un papel fundamental en la adaptación al nicho bacteriano clínicamente relevante. Además de contribuir al plegamiento del 40 % del proteoma de la envoltura celular (Dutton et al., 2008; Vertommen et al., 2008), el sistema DSB es esencial para la virulencia (Heras et al., 2009; Landeta et al., 2018), desempeña un papel clave en la formación y activación de células persistentes bacterianas (Wilmaerts et al., 2019) y, como se observa en este trabajo, es necesario para la supervivencia bacteriana en presencia de compuestos antibióticos ampliamente utilizados.
Como se muestra en nuestros experimentos in vivo, la focalización de dicho sistema en patógenos gramnegativos podría conducir a estrategias adyuvantes que inactiven los determinantes de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) a la vez que incapacitan un arsenal de factores de virulencia.
Este estudio no solo sienta las bases para futuras aplicaciones clínicas, como el desarrollo de adyuvantes antibióticos de amplia acción, sino que también sirve como paradigma para explotar otros procesos accesibles de proteostasis de la envoltura celular para el diseño de terapias de nueva generación.

NOTA: Este es un resumen general de un artículo publicado. El texto completo, las referencias, las tablas, los gráficos, las figuras y otros detalles se pueden encontrar en la revista mencionada al principio.

REFERENCIAS (101)

  1. Aires JR, Nikaido H. Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 2005;187:1923–1929. doi: 10.1128/JB.187.6.1923-1929.2005. - DOI - PMC - PubMed
  2. Alonso-Caballero A, Schönfelder J, Poly S, Corsetti F, De Sancho D, Artacho E, Perez-Jimenez R. Mechanical architecture and folding of E. coli type 1 pilus domains. Nature Communications. 2018;9:2758. doi: 10.1038/s41467-018-05107-6. - DOI - PMC - PubMed
  3. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 1990;215:403–410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2. - DOI - PubMedArts IS,
  4. Ball G, Leverrier P, Garvis S, Nicolaes V, Vertommen D, Ize B, Tamu Dufe V, Messens J, Voulhoux R, Collet J-F. Dissecting the machinery that introduces disulfide bonds in Pseudomonas aeruginosa. 2013;4:e00912-13. doi: 10.1128/mBio.00912-13. - DOI - PMC - PubMed
  5. Aubert D, Poirel L, Ali AB, Goldstein FW, Nordmann P. OXA-35 is an OXA-10-related beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2001;48:717–721. doi: 10.1093/jac/48.5.717. - DOI - PubMed
  6. Bardwell JC, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell. 1991;67:581–589. doi: 10.1016/0092-8674(91)90532-4. - DOI - PubMed
  7. Beyrouthy R, Robin F, Lessene A, Lacombat I, Dortet L, Naas T, Ponties V, Bonnet R. MCR-1 and OXA-48 In Vivo Acquisition in KPC-Producing Escherichia coli after Colistin Treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2017;61:e02540-16. doi: 10.1128/AAC.02540-16. - DOI - PMC - PubMed
  8. Blair JMA, Richmond GE, Piddock LJV. Multidrug efflux pumps in Gram-negative bacteria and their role in antibiotic resistance. Future Microbiology. 2014;9:1165–1177. doi: 10.2217/fmb.14.66. - DOI - PubMed
  9. \Blattner FR, Plunkett G, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 1997;277:1453–1462. doi: 10.1126/science.277.5331.1453. - DOI - PubMed
  10. Boyer HW, Roulland-Dussoix D. A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 1969;41:459–472. doi: 10.1016/0022-2836(69)90288-5. - DOI - PubMed
  11. Bush K. Past and Present Perspectives on β-Lactamases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2018;62:10. doi: 10.1128/AAC.01076-18. - DOI - PMC - PubMed
  12. Casadaban MJ, Cohen SN. Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 1980;138:179–207. doi: 10.1016/0022-2836(80)90283-1. - DOI - PubMed
  13. Chang AC, Cohen SN. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. Journal of Bacteriology. 1978;134:1141–1156. doi: 10.1128/jb.134.3.1141-1156.1978. - DOI - PMC - PubMed
  14. Clausen T, Southan C, Ehrmann M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Molecular Cell. 2002;10:443–455. doi: 10.1016/s1097-2765(02)00658-5. - DOI - PubMed
  15. Corkill JE, Cuevas LE, Gurgel RQ, Greensill J, Hart CA. SHV-27, a novel cefotaxime-hydrolysing beta-lactamase, identified in Klebsiella pneumoniae isolates from a Brazilian hospital. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2001;47:463–465. doi: 10.1093/jac/47.4.463. - DOI - PubMed
  16. Cox G, Wright GD. Intrinsic antibiotic resistance: mechanisms, origins, challenges and solutions. International Journal of Medical Microbiology. 2013;303:287–292. doi: 10.1016/j.ijmm.2013.02.009. - DOI - PubMed
  17. Dailey FE, Berg HC. Mutants in disulfide bond formation that disrupt flagellar assembly in Escherichia coli. 1993;90:1043–1047. doi: 10.1073/pnas.90.3.1043. - DOI - PMC - PubMed
  18. Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000;97:6640–6645. doi: 10.1073/pnas.120163297. - DOI - PMC - PubMed
  19. Denoncin K, Collet JF. Disulfide bond formation in the bacterial periplasm: major achievements and challenges ahead. Antioxidants & Redox Signaling. 2013;19:63–71. doi: 10.1089/ars.2012.4864. - DOI - PMC - PubMed
  20. Dortet L, Bréchard L, Poirel L, Nordmann P. Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae from blood cultures. Clinical Microbiology and Infection. 2014;20:340–344. doi: 10.1111/1469-0691.12318. - DOI - PubMed
  21. Dortet L, Poirel L, Abbas S, Oueslati S, Nordmann P. Genetic and Biochemical Characterization of FRI-1, a Carbapenem-Hydrolyzing Class A β-Lactamase from Enterobacter cloacae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2015;59:7420–7425. doi: 10.1128/AAC.01636-15. - DOI - PMC - PubMed
  22. Dortet L, Bonnin RA, Pennisi I, Gauthier L, Jousset AB, Dabos L, Furniss RCD, Mavridou DAI, Bogaerts P, Glupczynski Y, Potron A, Plesiat P, Beyrouthy R, Robin F, Bonnet R, Naas T, Filloux A, Larrouy-Maumus G. Rapid detection and discrimination of chromosome- and MCR-plasmid-mediated resistance to polymyxins by MALDI-TOF MS in Escherichia coli: the MALDIxin test. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2018;73:3359–3367. doi: 10.1093/jac/dky330. - DOI - PubMed
  23. Duprez W, Premkumar L, Halili MA, Lindahl F, Reid RC, Fairlie DP, Martin JL. Peptide inhibitors of the Escherichia coli DsbA oxidative machinery essential for bacterial virulence. Journal of Medicinal Chemistry. 2015;58:577–587. doi: 10.1021/jm500955s. - DOI - PubMed
  24. Dutton RJ, Boyd D, Berkmen M, Beckwith J. Bacterial species exhibit diversity in their mechanisms and capacity for protein disulfide bond formation. PNAS. 2008;105:11933–11938. doi: 10.1073/pnas.0804621105. - DOI - PMC - PubMed
  25. Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 2004;32:1792–1797. doi: 10.1093/nar/gkh340. - DOI - PMC - PubMed
  26. Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. 2010;26:2460–2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461. - DOI - PubMed
  27. El Garch F, Bogaerts P, Bebrone C, Galleni M, Glupczynski Y. OXA-198, an acquired carbapenem-hydrolyzing class D beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2011;55:4828–4833. doi: 10.1128/AAC.00522-11. - DOI - PMC - PubMed
  28. Finn RD, Clements J, Arndt W, Miller BL, Wheeler TJ, Schreiber F, Bateman A, Eddy SR. HMMER web server: 2015 update. Nucleic Acids Research. 2015;43:W30–W38. doi: 10.1093/nar/gkv397. - DOI - PMC - PubMed
  29. Gerken H, Misra R. Genetic evidence for functional interactions between TolC and AcrA proteins of a major antibiotic efflux pump of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 2004;54:620–631. doi: 10.1111/j.1365-2958.2004.04301.x. - DOI - PubMed
  30. Goemans C, Denoncin K, Collet JF. Folding mechanisms of periplasmic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 2014;1843:1517–1528. doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.10.014. - DOI - PubMed
  31. Haenni M, Beyrouthy R, Lupo A, Châtre P, Madec J-Y, Bonnet R. Epidemic spread of Escherichia coli ST744 isolates carrying mcr-3 and blaCTX-M-55 in cattle in France. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2018;73:533–536. doi: 10.1093/jac/dkx418. - DOI - PMC - PubMed
  32. Halili MA, Bachu P, Lindahl F, Bechara C, Mohanty B, Reid RC, Scanlon MJ, Robinson CV, Fairlie DP, Martin JL. Small molecule inhibitors of disulfide bond formation by the bacterial DsbA-DsbB dual enzyme system. ACS Chemical Biology. 2015;10:957–964. doi: 10.1021/cb500988r. - DOI - PubMed
  33. Hanahan D, Glover DM. DNA Cloning: A Practical Approach. IRL Press; 1985.
  34. Hart EM, Mitchell AM, Konovalova A, Sheng J, Han X, Rodriguez-Rivera FP, Schwaid AG, Malinverni JC, Balibar CJ, Bodea S, Si Q, Wang H, Homsher MF, Sutterlin H, Roemer T, Black TA, Rothman DM, Walker SS, Silhavy TJ. A small-molecule inhibitor of BamA impervious to efflux and the outer membrane permeability barrier. 2019;116:21748–21757. doi: 10.1073/pnas.1912345116. - DOI - PMC - PubMed
  35. Helander IM, Mattila-Sandholm T. Fluorometric assessment of gram-negative bacterial permeabilization. Journal of Applied Microbiology. 2000;88:213–219. doi: 10.1046/j.1365-2672.2000.00971.x. - DOI - PubMed
  36. Heras B, Kurz M, Shouldice SR, Martin JL. The name’s bond......disulfide bond. Current Opinion in Structural Biology. 2007;17:691–698. doi: 10.1016/j.sbi.2007.08.009. - DOI - PubMed
  37. Heras B, Shouldice SR, Totsika M, Scanlon MJ, Schembri MA, Martin JL. DSB proteins and bacterial pathogenicity. Nature Reviews. Microbiology. 2009;7:215–225. doi: 10.1038/nrmicro2087. - DOI - PubMed\
  38. Heras B, Scanlon MJ, Martin JL. Targeting virulence not viability in the search for future antibacterials. British Journal of Clinical Pharmacology. 2015;79:208–215. doi: 10.1111/bcp.12356. - DOI - PMC - PubMed
  39. Herrero M, de Lorenzo V, Timmis KN. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 1990;172:6557–6567. doi: 10.1128/jb.172.11.6557-6567.1990. - DOI - PMC - PubMed
  40. Hill L, Veli N, Coote PJ. Evaluation of Galleria mellonella larvae for measuring the efficacy and pharmacokinetics of antibiotic therapies against Pseudomonas aeruginosa infection. International Journal of Antimicrobial Agents. 2014;43:254–261. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2013.11.001. - DOI - PubMed
  41. Hiniker A, Bardwell JCA. In vivo substrate specificity of periplasmic disulfide oxidoreductases. The Journal of Biological Chemistry. 2004;279:12967–12973. doi: 10.1074/jbc.M311391200. - DOI - PubMed
  42. Hizukuri Y, Yakushi T, Kawagishi I, Homma M. Role of the intramolecular disulfide bond in FlgI, the flagellar P-ring component of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 2006;188:4190–4197. doi: 10.1128/JB.01896-05. - DOI - PMC - PubMed
  43. Kadokura H, Katzen F, Beckwith J. Protein disulfide bond formation in prokaryotes. Annual Review of Biochemistry. 2003;72:111–135. doi: 10.1146/annurev.biochem.72.121801.161459. - DOI - PubMed
  44. Kadokura H, Tian H, Zander T, Bardwell JCA, Beckwith J. Snapshots of DsbA in action: detection of proteins in the process of oxidative folding. Science. 2004;303:534–537. doi: 10.1126/science.1091724. - DOI - PubMed
  45. Kaniga K, Delor I, Cornelis GR. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. 1991;109:137–141. doi: 10.1016/0378-1119(91)90599-7. - DOI - PubMed
  46. Kessler B, de Lorenzo V, Timmis KN. A general system to integrate lacZ fusions into the chromosomes of gram-negative eubacteria: regulation of the Pm promoter of the TOL plasmid studied with all controlling elements in monocopy. Molecular & General Genetics. 1992;233:293–301. doi: 10.1007/BF00587591. - DOI - PubMed
  47. Kim J, Webb AM, Kershner JP, Blaskowski S, Copley SD. A versatile and highly efficient method for scarless genome editing in Escherichia coli and Salmonella enterica. BMC Biotechnology. 2014;14:84. doi: 10.1186/1472-6750-14-84. - DOI - PMC - PubMed
  48. Kishigami S, Akiyama Y, Ito K. Redox states of DsbA in the periplasm of Escherichia coli. FEBS Letters. 1995;364:55–58. doi: 10.1016/0014-5793(95)00354-c. - DOI - PubMed
  49. Landeta C, Blazyk JL, Hatahet F, Meehan BM, Eser M, Myrick A, Bronstain L, Furie BC, Furie B, Beckwith J, Dutton R, Boyd D. Compounds targeting disulfide bond forming enzyme DsbB of Gram-negative bacteria. Nature Chemical Biology. 2015;11:292–298. doi: 10.1038/nchembio.1752. - DOI - PMC - PubMed
  50. Landeta C, Boyd D, Beckwith J. Disulfide bond formation in prokaryotes. Nature Microbiology. 2018;3:270–280. doi: 10.1038/s41564-017-0106-2. - DOI - PubMed