LABORATORIO DE URGENCIAS

 

 

Zoster Virus – Aumenta el Riesgo de Stroke. 

Andrew N Bubak, Christina Coughlan,Janelle Posey, Anthony J Saviola, Christy S Niemeyer, Serena W R Lewis, Cassidy Delaney et al. 

The J.Infectious Diseases (April 2023);Vol 227;Issue 8;Pages 993-1001                                
                    https://doi.org/10.1093/infdis/jiac405

 

 

Varios virus, incluido el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), se asocian con accidentes cerebrovasculares; sin embargo, los mecanismos por los cuales la infección desencadena la enfermedad, incluso semanas o meses después de que la infección aparentemente se haya resuelto, no están bien caracterizados. Entre estos patógenos, el accidente cerebrovascular asociado con el virus de la varicela zóster (VVZ) es el más reportado. El VVZ es un virus de ADN bicatenario que causa varicela y luego establece una latencia de por vida en las neuronas ganglionares en más del 95 % de los estadounidenses [1, 2]. La reactivación del VVZ desde los ganglios y la propagación al/los dermatoma(s) correspondiente(s) produce herpes zóster (HZ; culebrilla), que afecta a 1 de cada 3 personas a lo largo de su vida [3]. El HZ ahora se reconoce como un factor de riesgo de accidente cerebrovascular. En datos agrupados de 9 estudios, el riesgo relativo (RR) de ictus es de 1,78 (intervalo de confianza del 95 %, 1,70-1,88) durante el primer mes tras el HZ, disminuyendo progresivamente a 1,20 (1,14-1,26) al cabo de un año [4]. El riesgo de ictus es mayor si el HZ se distribuye por vía oftálmica (RR al mes: 2,05 [intervalo de confianza del 95 %, 1,82-2,31]) y si el HZ se presenta en personas menores de 40 años que no cumplen los requisitos para la vacuna contra el HZ [RR al año: 2,96 [1,05-8,41]] [4].
La base biológica del ictus asociado al HZ se explica, en parte, por la infección directa de las arterias cerebrales por VZV, que provoca inflamación vascular, pérdida de células musculares lisas de la media, acumulación de miofibroblastos en la íntima y, en última instancia, ictus isquémico o hemorrágico [5]. Múltiples informes apuntan a otro mecanismo no mutuamente excluyente, ya que la infección por VZV provoca anomalías de la coagulación y el desarrollo de trombosis de los senos venosos cerebrales y otras complicaciones trombóticas [6-13]. Una característica mecanicista notable es la participación de factores solubles que promueven la vasculitis o la trombosis distal al lugar de la erupción.
Los exosomas circulantes se han convertido en importantes "factores solubles" que pueden afectar a células alejadas de su lugar de origen. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (de unos 40 a 160 nm de diámetro) de origen endosómico que transportan carga (proteínas, ácidos nucleicos) desde sus células de origen a células adyacentes o distales para su comunicación durante estados normales y patológicos, regulando los procesos biológicos y la respuesta a la enfermedad [14]. Estudios previos han demostrado que los exosomas derivados del cáncer pueden inducir la activación y agregación plaquetaria [15, 16]. Realizamos un estudio piloto para determinar si los exosomas plasmáticos de individuos con HZ, en comparación con aquellos sin HZ, contenían factores que promovieran la activación plaquetaria y la trombosis, lo que podría potenciar el accidente cerebrovascular.

MÉTODOS

Aislamiento y validación de exosomas
Los exosomas plasmáticos se aislaron mediante el sistema de aislamiento SmartSEC EV (System Biosciences) y posteriormente se caracterizaron con el instrumento NanoSight NS300 (Malvern Panalytical) para determinar la distribución de tamaño. Se prepararon para espectrometría de masas (EM) y ensayos de activación plaquetaria.
EM y proteómica
Los pellets de exosomas se analizaron mediante cromatografía líquida con EM en tándem (LC-EM/EM) en el Centro de Recursos Compartidos de Proteómica de EM, ubicado en UC-AMC. Los pellets se solubilizaron en 8 mol/L de urea/0,1 mol/L de Tris (pH 8,5) y las concentraciones de proteínas se determinaron con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Para cada muestra, 50 μg de proteína se redujeron con 5 mmol/L de tris(2-carboxietil)fosfina durante 20 minutos y se alquilaron con 50 mmol/L de 2-cloro-2-yodacetamida durante 15 minutos (en oscuridad y a temperatura ambiente [TA]). Las muestras se diluyeron con 4 volúmenes de 100 mmol/L de Tris-clorhidrato (pH 8,5) y luego se digirieron con tripsina de grado secuencial (Promega) en una proporción enzima-sustrato de 1:50 durante la noche a 37 °C. Se añadió ácido fórmico (AF) a las muestras a una concentración del 5% y los péptidos tripsídicos se purificaron con puntas Pierce C18 (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Los digestos se secaron al vacío y se resuspendieron en AF al 0,1%. La LC-MS/MS se realizó con un instrumento Easy nLC 1200 acoplado a un espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos tripsídicos se cargaron en una columna C18 (20 cm con un diámetro interior de 100 μm) empaquetada internamente con una columna de resina Cortecs C18 de 2,7 μm y se separaron a un caudal de 0,4 μl/min con las soluciones A (0,1 % de ácido fólico) y B (0,1 % de ácido fólico en ACN) en las siguientes condiciones: isocrático con la solución B al 4 % durante 3 minutos, seguido de la solución B al 4 %–32 % durante 102 minutos, la solución B al 32 %–55 % durante 5 minutos, la solución B al 55 %–95 % durante 1 minuto y el isocrático con la solución B al 95 % durante 9 minutos.
La LC-MS/MS se realizó mediante un método de adquisición dependiente de los datos top-15 con exclusión dinámica establecida en 20 segundos. Los espectros de fragmentación se interpretaron utilizando la plataforma computacional FragPipe basada en MSFragger [18] con las bases de datos combinadas de proteomas humanos y de VZV UniProtKB/SwissProt. Los señuelos inversos y los contaminantes se incluyeron automáticamente. La tolerancia de masa del precursor y la tolerancia de masa del fragmento se establecieron en 10 ppm y 0,2 Da, respectivamente.
La carbamidometilación de cisteína se seleccionó como modificación fija y la oxidación como modificación variable. Se permitieron dos escisiones trípticas omitidas, y la tasa de falsos descubrimientos a nivel de proteína fue ≤1 %. Los cambios en el plegamiento de la proteína se calcularon comparando los valores de intensidad espectral de HZ de cada proteína con los niveles sin HZ. La expresión diferencial significativa de las proteínas identificadas entre muestras con y sin HZ se determinó mediante el método de incremento gradual de dos etapas (Benjamini, Krieger y Yekutieli) con una tasa de falsos descubrimientos de q < 0,05 y el software estadístico GraphPad Prism 9 (GraphPad). Los análisis bioinformáticos y de enriquecimiento se realizaron utilizando las bases de datos STRING v11 (http://string-db.org) y PANTHER v17 (http://pantherdb.org), que implementan sistemas de clasificación reconocidos como Gene Ontology y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG).
Evaluación de la activación plaquetaria mediante citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó diluyendo las plaquetas lavadas (recuento plaquetario, 1 × 106/mL) en 100 μL de tampón de Tyrode caliente con 1 mmol/L de cloruro de calcio. Las plaquetas se activaron durante 20 minutos a 37 °C en oscuridad con trombina (0,1 U/mL; Chrono-log), calcimicina (A23187; 5 μmol/L, Sigma-Aldrich), exosomas HZ o no HZ al 20 % por volumen en presencia de anticuerpo anti-CD41-BV421 humano (Biolegend; clon n.° HIP8; 1:20), anti-P-selectina-aloficocianina ratón/humana (Biolegend; clon n.° APM-1; 1:25) y anti-β-lactadherina-isotiocianato de fluoresceína ratón/humana (FITC) (Prolytics, 1:20). Se utilizaron controles sin teñir y con fluorescencia negativa para determinar la activación de anticuerpos monoclonales (mAb). Dos agonistas plaquetarios, la trombina y la calcimicina, se utilizaron como controles, ya que activan las plaquetas a través de diferentes mecanismos, lo que da lugar a subpoblaciones únicas de plaquetas activadas. La trombina activa las plaquetas humanas a través de los receptores 1 y 4 activados por proteasas [19], lo que lleva a la liberación de proteínas de los gránulos α, incluida la P-selectina. La calcimicina causa una activación de las plaquetas no mediada por receptores a través de la elevación de la concentración intracelular de iones de calcio, que induce la translocación de fosfatidilserina (PS) a la superficie plaquetaria, produciendo subpoblaciones plaquetarias procoagulantes [20, 21]. El ensayo se extinguió a los 20 minutos diluyendo la sangre 1:5 con paraformaldehído (PFA) al 1% a temperatura ambiente en tampón de Tyrode. Las plaquetas se diferenciaron de los glóbulos blancos y los restos por tamaño utilizando dispersión frontal y lateral y se definieron como CD41+. Para la detección de P-selectina y PS en plaquetas, se capturaron 100 000 plaquetas y se analizaron para la expresión de P-selectina y β-lactadherina (PS). Las muestras se analizaron en el analizador Gallios 561 (Beckman Coulter). La unión específica de mAb se expresó como porcentaje de células positivas. Los datos de citometría de flujo se analizaron con el software de análisis de flujo Kaluza (Beckman Coulter).
Evaluación por citometría de flujo de agregados plaquetarios-leucocitos
Para la caracterización de agregados plaquetarios-leucocitos, se alicuotaron 200 μL de sangre diluida y citratada en tubos de 2,0 mL. Se añadieron exosomas HZ o no HZ al 20 % por volumen en presencia de anticuerpo anti-CD41-BV421 humano (Biolegend; clon n.° HIP8; 1:20), anti-CD45 humano (BD Biosciences; clon n.° 2D1; 1:20), anti-CD15-ficoeritrina/cianina 7 humana (Biolegend; clon n.° W6D3; 1:20) y anti-CD14-ficoeritrina humana (Biolegend; clon n.° 63D3; 1:20). Las muestras de sangre se tiñeron durante 20 minutos a 37 °C en oscuridad. El ensayo se extinguió con 1,5 ml de tampón de lisis de separación celular activado por fluorescencia de BD y se fijó durante 15 minutos.Las muestras se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células fijadas se resuspendieron en tampón de lisis de separación celular activado por fluorescencia BD.
Para clasificar los agregados plaquetas-leucocitos, se capturaron 20 000 leucocitos y se segregaron utilizando discriminación básica de propiedades de dispersión lateral (área de dispersión lateral × dispersión frontal) y CD45+. Se utilizaron anticuerpos específicos del subtipo leucocitario para confirmar las poblaciones leucocitarias: neutrófilos (CD14+lo, CD15+) y monocitos (CD14+hi, CD15−). Se analizaron los leucocitos, monocitos y neutrófilos totales para determinar la positividad de CD41 para medir el porcentaje de agregados plaquetas-leucocitos, plaquetas-monocito y plaquetas-neutrófilos. La unión específica de mAb se expresó como el porcentaje de células positivas en la puerta objetivo. Las muestras se analizaron en el analizador Gallios 561 (Beckman Coulter). Los datos se analizaron con el software de análisis de flujo Kaluza (Beckman Coulter; ejemplo de estrategia de selección).

RESULTADOS

Proteínas únicas asociadas con vías infecciosas e inmunorreguladoras en exosomas plasmáticos de HZ
Se recogieron muestras de plasma de 13 individuos con HZ agudo y 10 sin HZ; de los 13 con HZ, 3 (HZ8, HZ9 y HZ13) también proporcionaron muestras 2 semanas y 3 meses después del HZ. Se extrajeron los exosomas y un subconjunto se analizó mediante (1) análisis de seguimiento de nanopartículas con tamaños de partícula medio y moda de 139,4 (error estándar de la media, 14,27) nm y 86,9 (49) nm, respectivamente, en consonancia con el rango de tamaño de los exosomas [14], y (2) espectrometría de masas (EM), que detectó un total de 590 moléculas únicas, todas de origen humano. De estas proteínas, 86 mostraron una expresión significativamente positiva en los exosomas con HZ, en comparación con los exosomas sin HZ; ninguna proteína mostró una expresión significativamente negativa. Los exosomas con y sin HZ no contenían proteínas VZV y no fueron infecciosos; un subconjunto (HZ8, HZ9 y HZ13) aplicado a células no infectadas no produjo efecto citopático (datos no mostrados). El análisis de componentes principales reveló una clara agrupación de las muestras entre los grupos con y sin HZ; no se observó una agrupación distintiva al analizar las muestras con HZ de forma independiente según la localización de la erupción (HZ oftálmico frente a HZ cervical, torácico, lumbar y sacro). Los análisis de enriquecimiento de todas las moléculas identificadas revelaron listas de proteínas consistentes con exosomas extracelulares, micropartículas sanguíneas y vesículas, lo que confirma que las partículas plasmáticas aisladas eran predominantemente de origen exosomal.
Los exosomas de HZ contenían 41 moléculas que no se detectaron en exosomas no HZ, de las cuales 18 moléculas se encontraban en la gran mayoría de las muestras de HZ (10-13 de un total de 13 muestras de HZ), y las 23 moléculas restantes se encontraban en 7-9 de un total de 13 muestras de HZ.
Las funciones de estas moléculas se asociaron predominantemente con la unión de proteínas, iones y derivados de carbohidratos, así como con la actividad de hidrolasas, oxidorreductasas y ligasas. En general, en comparación con los exosomas no HZ, los exosomas de HZ contenían 127 proteínas notables, de las cuales 86 estaban significativamente sobreexpresadas y 41 se encontraron solo en exosomas de HZ. Las moléculas con sobreexpresión mostraron un enriquecimiento significativo en la interacción entre sí (p ajustada < 0,001), superior al esperado para un conjunto aleatorio de moléculas del mismo tamaño y grado de distribución extraídas del genoma. Esto indica que las moléculas significativamente elevadas están biológicamente conectadas (Figura 2A recuadro; agrupamiento de k-medias establecido en 3 grupos). Los análisis de enriquecimiento de las vías de las moléculas significativamente elevadas en los exosomas de HZ revelaron vías implicadas en enfermedades infecciosas, incluyendo la regulación positiva por parte del huésped del proceso viral/replicación genómica, la carcinogénesis viral y la miocarditis viral. De manera similar, se detectó un enriquecimiento significativo de las vías de respuesta inmunitaria, incluyendo la activación del complemento, la migración transendotelial de leucocitos, la respuesta celular al interferón γ y el procesamiento y la presentación de antígenos.
Enriquecimiento de las vías de enfermedades cerebrovasculares y cardiovasculares en exosomas de HZ
Análisis adicionales de enriquecimiento de HZ en comparación con exosomas sin HZ revelaron vías asociadas con la activación, señalización y agregación plaquetaria, la coagulación sanguínea, la miocardiopatía hipertrófica y la formación de coágulos de fibrina. Las proteínas específicas significativamente elevadas en los exosomas de HZ e implicadas en la activación, señalización y agregación plaquetaria incluyeron trombospondina 1, proteína 2 asociada a caveolas, factor de coagulación V y cadena A1 del factor XIII de coagulación. Las proteínas de enfermedades del sistema cardiovascular elevadas en los exosomas de HZ incluyeron calmodulina 1 y transtiretina. La transtiretina también está involucrada en la amiloidosis cardíaca [23], lo cual es intrigante dados los estudios previos que demuestran que el plasma de pacientes con HZ agudo contiene amiloide elevado y es amiloidogénico [17].
El Stroke/ictus puede ocurrir meses después del HZ [24]; por lo tanto, analizamos un subconjunto de exosomas disponibles 2 semanas y 3 meses después del HZ. Las proteínas de interés elevadas en el momento agudo se mantuvieron elevadas hasta 3 meses después del HZ.
Actividad protrombótica y proinflamatoria en exosomas plasmáticos de HZ
Para determinar la importancia funcional de estos exosomas en el contexto de la enfermedad vascular asociada al HZ, expusimos plaquetas humanas a exosomas con o sin HZ y, a continuación, medimos la expresión de P-selectina y PS; estos marcadores se regulan positivamente en las plaquetas tras la activación, lo que favorece la adhesión plaqueta-endotelial y/o plaqueta-leucocito y la generación de trombina, respectivamente [20, 21, 25]. En comparación con los exosomas sin HZ, las plaquetas expuestas a exosomas de HZ presentaron una expresión significativamente mayor de P-selectina y PS; este efecto se mantuvo en las muestras de exosomas 3 meses después del HZ. Cabe destacar que se detectaron niveles más altos de P-selectina en muestras de exosomas con HZ que en muestras sin HZ, lo que sugiere que el aumento de la P-selectina plaquetaria podría deberse en parte a la carga liberada por los exosomas con HZ; sin embargo, no se detectó PS en ninguna muestra de exosomas, lo que indica que los exosomas con HZ indujeron su expresión en plaquetas.
Para corroborar estos hallazgos funcionales, expusimos plaquetas a exosomas con o sin HZ y observamos que la exposición a exosomas con HZ, pero no a exosomas sin HZ, resultó en un aumento significativo de los agregados leucocitarios (monocitos y neutrófilos); los exosomas de muestras 3 meses después de HZ no mostraron diferencias significativas con respecto a los exosomas sin HZ. Finalmente, dado que la inflamación persistente es un sello distintivo del HZ y las enfermedades asociadas al HZ, evaluamos si estos puntos temporales posteriores pueden inducir un entorno proinflamatorio mediante la exposición de fibroblastos vasculares adventicios de cerebro humano ingenuos a exosomas no HZ y 3 meses después del HZ, y la posterior medición de IL-6 e IL-8 secretadas; estos niveles de citocinas se elevan durante la infección por VZV in vitro e in vivo [26, 27]. En comparación con los exosomas no HZ, los de muestras 3 meses después del HZ aumentaron significativamente la secreción de IL-6 e IL-8 de fibroblastos vasculares adventicios de cerebro humano.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, observamos que los exosomas plasmáticos protrombóticos y proinflamatorios están presentes durante el HZ agudo y pueden persistir hasta 3 meses, lo que proporciona un nuevo mecanismo no infeccioso por el cual el VZV, y probablemente otros virus, aumenta el riesgo de accidente cerebrovascular. El origen de la población heterogénea de exosomas aún está por determinar, pero es muy probable que un subconjunto provenga de neuronas ganglionares, donde el VVZ latente se reactivó y replicó. Dado que los exosomas se producen continuamente, la presencia de estos exosomas patógenos 3 meses después del HZ plantea la posibilidad de una replicación viral continua de bajo grado en las neuronas ganglionares, lo que resulta en una producción continua de exosomas patógenos a pesar de la desaparición de la erupción.
El respaldo a la replicación viral continua después del HZ proviene de:
(1) la eliminación intermitente de ADN del VVZ en la saliva de algunos individuos con HZ (67%) hasta 12 años después del HZ, en comparación con ninguna en los controles sin HZ [28];
(2) la detección de ADN del VVZ en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos con HZ hasta 7 semanas después[29]
(3) ADN intermitente de VZV en PBMC que desapareció durante los episodios de terapia antiviral en un individuo con neuralgia posherpética [30], así como la detección de ADN de VZV en las PBMC del 33 % de los pacientes con neuralgia posherpética en muestras de sangre obtenidas en serie ≥1 año después del HZ [31);
(4) la presencia de antígeno y ADN de VZV en ganglios trigéminos post mortem de un individuo con HZ 2 años antes [32].
Estos hallazgos sugieren que el VZV no vuelve a la latencia en un subconjunto de individuos y que un estado protrombótico prolongado puede continuar después de completar la terapia antiviral y la desaparición de la erupción. Con respecto al tratamiento clínico, nuestros hallazgos sugieren un papel potencial para una terapia antiviral de mayor duración, además de agentes antiplaquetarios y antiinflamatorios, así como iniciativas para aumentar la aceptación de la vacuna contra el HZ para disminuir el riesgo de accidente cerebrovascular [33], particularmente en individuos con factores de riesgo de accidente cerebrovascular conocidos, que incluyen aterosclerosis preexistente, estenosis y déficits de coagulación.
Una limitación del presente estudio es su pequeño tamaño de muestra (HZ agudo, n = 13; 2 semanas y 3 meses después del HZ, n = 3). Específicamente, nuestro estudio se centró principalmente en puntos temporales de HZ agudo sin eventos vasculares adversos observados en el corto período de seguimiento. Aunque registramos cambios estadísticamente significativos durante el HZ agudo y 3 meses después del HZ con respecto a la activación plaquetaria y la inducción de inflamación con esta pequeña cohorte, se justifican estudios de seguimiento que se extiendan a 1 año después del HZ con una cohorte más grande para considerar los cambios temporales en la actividad protrombótica y proinflamatoria de los exosomas, las condiciones comórbidas (p. ej., diabetes mellitus, hipertensión, hiperlipidemia y uso de tabaco) y el desarrollo de complicaciones vasculares.
Un rango más amplio de edades será informativo, dado que el riesgo elevado de accidente cerebrovascular después del HZ es mayor en individuos <40 años de edad que en todos los demás grupos de edad [4]. El grupo de HZ en el presente estudio tenía una media de edad más alta (62 años); Nuestra hipótesis es que el estado protrombótico y proinflamatorio conferido por los exosomas patógenos sería aún mayor en un grupo de personas con HZ más jóvenes (menores de 40 años), en consonancia con los datos epidemiológicos [4]. Cabe destacar que este grupo más joven no es elegible para la vacuna contra el HZ, lo que agrava aún más el riesgo. Si bien nuestro estudio encontró exosomas protrombóticos en personas con HZ, es posible que se generen exosomas patógenos similares durante la varicela, lo que provoca complicaciones trombóticas. Esto se ve respaldado por informes de trombosis venosa cerebral y embolia pulmonar asociados con la varicela [10, 12, 13, 34]. Sin embargo, se requiere un estudio futuro con muestras de varicela para respaldar esta hipótesis.
Nuestros hallazgos abren nuevas vías de investigación para explorar los exosomas patógenos que aumentan el riesgo de ictus y su persistencia en otras infecciones virales. El papel de los exosomas protrombóticos persistentes en el ictus asociado a la infección por SARS-CoV-2 es de particular importancia, ya que se han observado complicaciones trombóticas meses después de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) o de una infección asintomática [35, 36]. En estos casos, la infección por SARS-CoV-2 puede producir exosomas protrombóticos patógenos. Sin embargo, también es posible que la reactivación del virus de la varicela zóster (VZV) y los exosomas del herpes simple (HZ) contribuyan adicionalmente a los ictus asociados a la COVID-19; un estudio publicado en 2022 mostró que las personas ≥50 años con COVID-19 tienen un 15 % más de probabilidades de desarrollar HZ y un 21 % más de probabilidades si son hospitalizadas [37]. En general, nuestros prometedores resultados cambian el paradigma de las enfermedades infecciosas: una vez resuelta la infección, la enfermedad no ha terminado; los exosomas persistentes pueden continuar desencadenando respuestas patológicas que se cree que no están relacionadas con la infección original y que están alejadas de ella.

NOTA: Este es un resumen general de un artículo publicado. El texto completo, las tablas, los gráficos, las figuras y otros detalles se
           pueden encontrar en la revista mencionada en el comienzo..

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