LABORATORIO DE URGENCIAS

 

 

Acumulación de Neutrófilos Positivos para Mieloperoxidasa en Aterosclerosis

Marcella van Leeuwen, Marion J.J. Gijbels, Adriaan Duijvestijn, Marjan Smook, Marie José van de Gaar, Peter Heeringa, Menno P.J. de Winther, and Jan Willem Cohen Tervaert
   *Departments of Clinical and Experimental Immunology, Molecular Genetics , and Pathology, Cardiovascular Research Institute Maastricht, Maastricht University.
   * Department of Pathology and Laboratory Medicine (P.H.), Medical Biology Section, University Medical Center Groningen, Groningen, the Netherlands.

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology (Nov 2009); Vol 28; Number 1
https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.107.154807

 

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica multifactorial con una participación destacada del sistema inmunitario. Aunque aún no se comprende completamente, la aterogénesis probablemente sea el resultado de una compleja interacción entre diversos tipos de células inmunitarias y no inmunitarias. Las células inmunitarias más abundantes en las lesiones ateroscleróticas son los macrófagos derivados de monocitos y las células T.1,2. Por lo tanto, estas células se consideran los actores inmunológicos clave en la aterogénesis y han sido ampliamente estudiadas. En contraste, los neutrófilos, el principal componente celular del sistema inmunitario innato, han recibido poca atención, y su presencia histológica en las lesiones ateroscleróticas no se había descrito en detalle hasta ahora.
Los neutrófilos son fagocitos profesionales, cuya función principal es detectar y destruir organismos patógenos. Además, son los leucocitos más prominentes en las reacciones inflamatorias agudas y contribuyen al daño tisular del huésped en diversas afecciones inflamatorias, como la lesión por isquemia-reperfusión, la sepsis y la vasculitis.3. Es importante destacar que, al ser el componente celular clave de la respuesta inflamatoria aguda, se cree que los neutrófilos contribuyen al inicio y la modulación de la respuesta inmunitaria.4. Por ejemplo, los neutrófilos generan quimiocinas que reclutan monocitos y células dendríticas y pueden determinar si los macrófagos se diferencian hacia un fenotipo predominantemente proinflamatorio o antiinflamatorio.
Aunque no se ha investigado exhaustivamente, existe evidencia indirecta que implica un papel de los neutrófilos en el proceso de aterogénesis. En primer lugar, los ratones ateroscleróticos deficientes en P-selectina o E-selectina muestran una menor formación de lesiones.5,6. Dado que las selectinas desempeñan un papel fundamental en la adhesión y el rodamiento de los neutrófilos a lo largo del endotelio, se podría postular que los neutrófilos participan en la aterosclerosis. En modelos humanos y murinos de aterosclerosis, se ha demostrado una infiltración distintiva de neutrófilos en lesiones rotas y lesiones causantes, lo que sugiere un papel de estas células en la desestabilización de las lesiones ateroscleróticas.7,8 Además, los niveles plasmáticos de mieloperoxidasa, la enzima más abundante de los neutrófilos almacenada en los gránulos azurófilos, se asocian con la presencia de enfermedad coronaria en humanos.9
Asimismo, los niveles de MPO se elevan en pacientes con dolor torácico y predicen el riesgo de un evento cardíaco adverso mayor.10 Por otra parte, se ha encontrado una correlación entre el recuento de neutrófilos y la aparición y gravedad de la aterosclerosis carotídea en pacientes.11
Sin embargo, no todos los estudios han encontrado que los niveles plasmáticos de mieloperoxidasa estén relacionados con la enfermedad coronaria.12 No obstante, el papel de los neutrófilos en la aterogénesis aún no está claro. Como primer paso para abordar este problema, el presente estudio se diseñó para investigar la presencia de neutrófilos y mieloperoxidasa durante el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones deficientes en el receptor de lipoproteínas de baja densidad (ratones LDLR−/−), propensos a la aterosclerosis.

MÉTODOS

Se obtuvieron ratones hembra LDLR−/− y apoE−/− con fondo genético C57BL/6 del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine). Tres grupos experimentales de 7 ratones y un grupo control de 6 ratones LDLR−/− de 14 a 16 semanas de edad fueron alimentados con una dieta rica en grasas (Hope Farms) o con pienso estándar. Tras 6, 10 y 16 semanas de dieta o 16 semanas de pienso estándar, los ratones fueron sacrificados tras un ayuno nocturno.
Además, se realizó una primera comparación entre ratones LDLR−/− y ratones apoE−/− (otro modelo murino de aterosclerosis). Los niveles plasmáticos de colesterol (Sigma-Aldrich) y mieloperoxidasa (Hycult Biotechnology) se determinaron mediante kits comerciales. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism (GraphPad Software Inc) y SPSS 12.0 para Windows.

Procesamiento de tejidos y análisis de lesiones ateroscleróticas
Se anestesiaron ratones y se extrajeron los corazones y los arcos aórticos, seccionándolos perpendicularmente al eje cardíaco justo debajo de las puntas auriculares. Se obtuvieron secciones de 7 μm a partir de la zona donde eran visibles las válvulas auriculoventriculares. Las áreas de las lesiones aórticas se cuantificaron mediante cortes transversales seriados obtenidos cada 42 μmol/L, comenzando en el inicio de las válvulas auriculoventriculares y abarcando 250 μmol/L. La gravedad de la lesión se clasificó mediante tinción con rojo Sirius para determinar el contenido de colágeno y se categorizó como se describió previamente 13. Tanto la gravedad como la necrosis de la lesión aterosclerótica fueron determinadas por un patólogo experimental.

Inmunohistoquímica
Todos los anticuerpos utilizados para la inmunohistoquímica se titularon inicialmente y se utilizaron a concentraciones saturadas. Se utilizaron controles de isotipo a las mismas concentraciones que los respectivos anticuerpos primarios. Todas las tinciones de control de isotipo mostraron ausencia de tinción (datos no mostrados). Para cuantificar los neutrófilos, se utilizó el anticuerpo monoclonal Ly-6G (clon 1A8; BD Biosciences Pharmingen, 2,5 μg/mL), un marcador específico de neutrófilos14,15. Para detectar la mieloperoxidasa, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón anti-MPO de ratón 8F4 (20 μg/mL)16 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) que se había generado en nuestro departamento (datos suplementarios que incluyen las figuras IIA y IIB).
La molécula de adhesión E-selectina se identificó mediante el anticuerpo monoclonal clon MES-1 y los macrófagos mediante el anticuerpo monoclonal CD68 (clon FA-11), utilizando sobrenadantes de cultivo de hibridoma. Las secciones congeladas de siete μm de espesor se fijaron con acetona a temperatura ambiente y se secaron al aire. Para obtener protocolos detallados sobre inmunohistoquímica, consulte los datos complementarios. Las imágenes de inmunofluorescencia se fusionaron digitalmente con Adobe Photoshop, versión 7.0, y las imágenes de microscopía confocal con ImageJ, versión 1.37. Un observador contó y puntuó los neutrófilos en las lesiones y en la capa adventicia de forma enmascarada.
El número de neutrófilos en las lesiones se expresó en relación con el área de la lesión por mm². Los neutrófilos en la capa adventicia, adyacente a la lesión, se clasificaron según la siguiente escala de gravedad: 0 = sin tinción (ninguna), 1 = de 1 a 10 neutrófilos (tinción leve), 2 = de 11 a 25 neutrófilos (tinción moderada) y 3 = más de 25 neutrófilos (tinción abundante).

RESULTADOS

Caracterización de la aterosclerosis
Para estudiar la presencia de neutrófilos en la aterosclerosis, se alimentó a ratones LDLR−/− con una dieta rica en grasas y se les practicó la eutanasia a las 6, 10 y 16 semanas para estudiar el inicio y la progresión de la aterosclerosis. Como grupo control, se mantuvo un grupo de ratones con dieta estándar durante 16 semanas. Se midieron el peso corporal y los niveles de colesterol antes de comenzar la dieta rica en grasas.
No se observaron diferencias significativas entre los grupos en cuanto al peso corporal y los niveles de colesterol antes del inicio del experimento. Durante el experimento, el peso corporal y los niveles de colesterol aumentaron en los grupos experimentales, mientras que el grupo control solo experimentó un aumento de peso. El área media de las lesiones ateroscleróticas en los grupos experimentales mostró un aumento significativo con el tiempo.

Gravedad de las lesiones en ratones LDLR−/−
Tras 6, 10 y 16 semanas de dieta rica en grasas, se caracterizó la gravedad de las lesiones ateroscleróticas en el área de la válvula aórtica (AVA). En la semana 6 se observaron lesiones mixtas tempranas, intermedias y avanzadas. Después de 10 semanas, predominaron las lesiones de la etapa intermedia y avanzada, mientras que después de 16 semanas, la mayoría de las lesiones se caracterizaron como avanzadas.

Acumulación de Neutrófilos durante el Desarrollo de la Aterosclerosis
Durante la progresión de la aterosclerosis, los macrófagos se encuentran abundantemente presentes en las lesiones. Para identificar los neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas, se realizó inmunohistoquímica con el marcador específico de neutrófilos Ly-6G.
Al clasificar las lesiones y correlacionarlas con el período de dieta, encontramos que los neutrófilos positivos para Ly-6G estaban presentes en las lesiones en los tres momentos evaluados. Los neutrófilos no estaban presentes en las lesiones tempranas, que solo se observaron en el grupo eutanasiado a las 6 semanas y consistían principalmente en macrófagos. Por otro lado, en el grupo de 6 semanas, se observó una gran cantidad de neutrófilos infiltrados en las lesiones intermedias y avanzadas, lo que resultó en una puntuación promedio alta de infiltración de neutrófilos en este momento. Los momentos de 10 y 16 semanas también mostraron acumulación de neutrófilos en las lesiones intermedias y avanzadas. En las lesiones, se pudieron detectar neutrófilos en dos ubicaciones diferentes: en la lesión aterosclerótica misma y adheridos a la capa. Además, en el sitio de las lesiones ateroscleróticas se encontraron neutrófilos en la lámina adventicia de la aorta. La mayoría de las lesiones mostraron neutrófilos presentes tanto en la capa lesional como en la adventicia, mientras que raramente se observaron en el núcleo de las lesiones que consistía en células espumosas derivadas de macrófagos. Un ejemplo típico de este patrón de distribución de neutrófilos se muestra en la Figura 1P. La Figura 1O muestra una alta magnificación de un neutrófilo Ly-6G positivo con un núcleo multilobulado y un monocito Ly-6G negativo con un núcleo en forma de frijol.
Para estudiar con más detalle la distribución de neutrófilos en comparación con la de macrófagos, se realizó una tinción de CD68 para macrófagos en secciones adyacentes. Dentro de la lesión aterosclerótica, la distribución de macrófagos fue diferente a la de neutrófilos. Se analizó la doble tinción con CD68 y Ly-6G mediante microscopía confocal, observándose ausencia de colocalización. Esto confirma que Ly-6G es exclusiva de los neutrófilos y no tiñe los monocitos o macrófagos CD68 positivos. Para investigar si la acumulación de neutrófilos en la aterosclerosis no es una característica específica del modelo de ratón LDLR−/−, también se estudió la presencia de neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas de ratones apoE−/−. En estas lesiones, también se demostró la presencia de neutrófilos, lo que sugiere que, en general, los neutrófilos participan en los modelos de ratón aterogénicos.
En el modelo de ratón LDLR−/−, no se encontraron diferencias significativas en el número de neutrófilos entre los diferentes momentos de medición, tras ajustar por el área media de la lesión (Figura 3). Aunque los valores medios mostraron una tendencia hacia un menor número de neutrófilos en el grupo de dieta de 16 semanas en comparación con el grupo de dieta de 10 semanas (Media 10 semanas HFD: 180 neutrófilos por mm2; 16 semanas HFD: 33 neutrófilos por mm2).
El número absoluto de neutrófilos en las lesiones se correlacionó fuertemente con la puntuación de gravedad de los neutrófilos en la capa adventicia (0,83, IC del 95 % 0,71 a 0,89, P<0,0001). Esto indica que estos diferentes sitios están involucrados de manera similar en el reclutamiento de neutrófilos en la lesión aterosclerótica. Debido a que en condiciones inflamatorias la atracción e infiltración de neutrófilos a menudo coincide con la necrosis, comparamos las áreas necróticas en las lesiones con la presencia de neutrófilos. El área de necrosis no se correlacionó con la acumulación de neutrófilos (datos no mostrados). Sin embargo, curiosamente, casi no se encontraron neutrófilos en las proximidades de los núcleos necróticos en las lesiones ateroscleróticas.
Para estudiar los factores implicados en la extravasación de neutrófilos hacia la lesión aterosclerótica, se investigó la expresión de la molécula de adhesión E-selectina. Ocasionalmente, se observó tinción de E-selectina en las células endoteliales que recubren la lesión. Mediante inmunotinción de secciones consecutivas, se constató que la tinción de E-selectina en el endotelio siempre coincidía con la presencia de neutrófilos.

Abundante expresión de neutrófilos con MPO en la lesión
La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima presente en las lesiones ateroscleróticas humanas¹⁷ y se sabe que es la enzima más abundante en los neutrófilos. Estudiamos la distribución de MPO en lesiones ateroscleróticas murinas utilizando un anticuerpo monoclonal 8F4, generado recientemente en nuestro laboratorio.¹⁶
En cortes de bazo murino, la doble tinción por inmunofluorescencia de MPO y Ly-6G mostró que los neutrófilos son el tipo celular predominante que contiene MPO en ratones, mientras que se observó una expresión débil de MPO en otras células, probablemente monocitos. La doble tinción de MPO y neutrófilos en lesiones ateroscleróticas a las 6, 10 y 16 semanas después de una dieta rica en grasas mostró que la MPO estaba presente en las lesiones y se colocalizaba fuertemente con los neutrófilos. Además, utilizamos un anticuerpo policlonal contra la MPO,18 que mostró un patrón de tinción similar al del anticuerpo monoclonal 8F4 en las lesiones ateroscleróticas.
No se observó colocalización de la MPO con los macrófagos, lo que concuerda con hallazgos previos que indican que los macrófagos en las lesiones ateroscleróticas murinas no expresan MPO.19,20 El análisis mediante microscopía confocal de secciones de bazo murino también demostró que la MPO se expresaba predominantemente en los neutrófilos. Se observó un patrón de tinción granular citoplasmática de MPO en células con un núcleo multilobulado distintivo, característico de los neutrófilos. Este patrón de tinción característico también se observó en las lesiones ateroscleróticas.

Los niveles plasmáticos circulantes de MPO aumentan durante el desarrollo de la aterosclerosis.
Dado que la MPO también se secreta a la circulación, medimos sus niveles plasmáticos durante el desarrollo de la aterosclerosis. Al comparar el grupo de control con los grupos experimentales, los grupos alimentados con una dieta alta en grasas mostraron niveles de MPO circulante significativamente aumentados. Seis semanas después de introducir la dieta alta en grasas, se observaron niveles significativamente más altos de MPO circulante en comparación con los niveles basales de MPO. Después de 10 semanas de dieta, los niveles plasmáticos de MPO disminuyeron, sin embargo, los valores medios aún estaban aumentados (aunque no significativamente) con respecto a los niveles basales (Media basal: 39 ng/mL; Media del grupo HFD de 10 semanas: 86 ng/mL).
A las 16 semanas de dieta, los niveles circulantes de MPO disminuyeron aún más, aunque permanecieron ligeramente elevados en comparación con las muestras de plasma obtenidas de los animales antes de comenzar la dieta o de los animales que habían sido mantenidos con alimento normal.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, investigamos la presencia y distribución de neutrófilos y la enzima MPO durante el desarrollo y la progresión de la aterosclerosis en ratones LDLR−/−. Se observó la presencia de neutrófilos en las distintas etapas intermedias y avanzadas de la aterosclerosis. No se identificaron neutrófilos en las lesiones tempranas, que consistían únicamente en células espumosas derivadas de macrófagos. Se observaron neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas, adheridos a la capa fibrosa y en la adventicia. Se encontró una fuerte correlación entre el número de neutrófilos en la lesión y la gravedad de la infiltración de neutrófilos en la adventicia circundante. Ocasionalmente, la infiltración de neutrófilos se localiza junto con la tinción de E-selectina en el endotelio. Hasta donde sabemos, este estudio constituye la primera descripción detallada de la participación y localización de los neutrófilos durante la aterogénesis en ratones LDLR−/−, uno de los modelos animales más utilizados para el estudio de la aterosclerosis.
Hasta ahora, los neutrófilos han recibido poca atención en el campo de la aterosclerosis. Sin embargo, ya en 1982, Trillo²¹ describió la presencia de neutrófilos en lesiones ateroscleróticas en monos mediante la identificación de la morfología nuclear. Además, existe evidencia indirecta del papel de los neutrófilos en la aterosclerosis. Por ejemplo, ratones deficientes en P-selectina, E-selectina o ambas⁵,⁶ mostraron una formación retardada de lesiones ateroscleróticas. Este retraso en el desarrollo de las lesiones se explicó principalmente por una menor afluencia de monocitos atribuible a la ausencia de selectinas.
Sin embargo, aunque no se abordó en estos estudios, el retraso en el desarrollo de las lesiones también podría deberse a una infiltración deficiente de neutrófilos, ya que las selectinas son reguladores clave de la infiltración de neutrófilos en los sitios inflamatorios.
Estudios realizados por Eriksson et al.²² han demostrado que los leucocitos que interactúan in vivo con el endotelio aterosclerótico son predominantemente neutrófilos. Por lo tanto, sugirieron un papel importante de los neutrófilos en la aterogénesis.
Chen et al.²³ aportaron evidencia del posible papel de los neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas al demostrar, en estudios in vitro, que en entornos de flujo complejos, como los que se encuentran en las lesiones ateroscleróticas, los neutrófilos se adhieren a la capa endotelial. Un indicio adicional de la infiltración de neutrófilos y su participación en el desarrollo de las lesiones proviene de estudios que describen la presencia de la interleucina (IL)-8, un quimioatrayente, en las lesiones ateroscleróticas.²⁴ La IL-8 es una quimiocina importante para el reclutamiento de neutrófilos en los sitios de inflamación.
En ratones, se ha demostrado que las quimiocinas MIP-2 y KC, homólogas funcionales de la IL-8 humana, están relacionadas con la extensión de la aterosclerosis.²⁴,²⁵ Los datos mencionados, junto con nuestras observaciones que muestran la presencia de neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas, sugieren un papel de los neutrófilos en la progresión de la aterogénesis. En este sentido, los monocitos y macrófagos, que son las primeras células inflamatorias observadas en las lesiones tempranas, son candidatos potenciales para iniciar el reclutamiento de neutrófilos.²⁶ Sin embargo, el papel preciso de los neutrófilos en la aterosclerosis aún no está claro.
Los neutrófilos pueden contribuir a la aterogénesis mediante la secreción de diversos mediadores inflamatorios. Dos clases importantes de productos liberados por los neutrófilos activados son los intermediarios reactivos de oxígeno (IRO) y las proteasas derivadas de neutrófilos.³,²⁶ En primer lugar, la activación del estallido respiratorio y los oxidantes derivados de la MPO, como el ácido hipocloroso, pueden contribuir al daño tisular al promover la peroxidación lipídica.²⁷
Nuestra demostración de neutrófilos positivos para MPO en las lesiones y los niveles plasmáticos de MPO significativamente más altos en comparación con los ratones control no aterogénicos podrían indicar un papel importante de la MPO en la aterosclerosis murina.
Múltiples estudios en humanos ya han demostrado una asociación entre los niveles de MPO en la circulación y el riesgo de enfermedad cardiovascular.9,10,28 En nuestro estudio, encontramos una relación entre los niveles plasmáticos de MPO y la extensión de la aterosclerosis. Particularmente en el inicio de la aterosclerosis (semana 6), se midieron altos niveles de MPO circulante, que posteriormente se atenuaron después de 10 y 16 semanas pero los niveles medios aún estaban aumentados. No se puede descartar que estos niveles elevados de MPO plasmática en la semana 6 se iniciaron por la introducción de una dieta alta en grasas.
En ratones transgénicos hipercolesterolémicos que sobreexpresan MPO humana en macrófagos, la aterosclerosis aumentó, lo que indica un papel agravante de la MPO.20 Por el contrario, se encontró un efecto protector de la enzima MPO cuando se estudiaron animales deficientes en MPO en aterosclerosis.19 Por lo tanto, el papel preciso de la MPO en la aterosclerosis aún no es concluyente. Además del estallido respiratorio, la degranulación de los neutrófilos activados causa la liberación de varias proteasas. Por ejemplo, las metaloproteinasas de matriz (MMP)-8 y MMP-9 son responsables de la degradación de componentes de la matriz como la laminina, el colágeno y los proteoglicanos.²⁶ Los productos mencionados anteriormente tienen una función antimicrobiana y se secretan para proteger al huésped contra los patógenos. Sin embargo, cuando se liberan en el contexto de una respuesta inflamatoria, como en la aterosclerosis, estos factores pueden tener un efecto proaterogénico²⁹ y podrían influir en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas al causar su ruptura. Varios estudios⁷,⁸ ya han demostrado la infiltración de neutrófilos en sitios cercanos a los trombos, lo que sugiere un posible papel de los neutrófilos en la desestabilización de la lesión.
Ell trabajo de Leclercq et al.³⁰ proporciona evidencia sustancial de la participación de los neutrófilos en la hemorragia intraplaca en la aterosclerosis humana.
Los neutrófilos también pueden, al liberar sus componentes lisosomales, contribuir al desarrollo de la necrosis.
Por otro lado, la necrosis puede ser un factor iniciador para el reclutamiento de neutrófilos. Aquí, no encontramos correlación entre la necrosis y la presencia de neutrófilos, lo que sugiere que otros factores, además de la necrosis, median el reclutamiento de neutrófilos.
En nuestros estudios, hemos utilizado el marcador Ly-6G para identificar de forma unívoca los neutrófilos en las lesiones ateroscleróticas.
Henderson et al.15 describieron que marcadores como NIMP-R14 y GR-1, ampliamente utilizados para definir el linaje de los neutrófilos, no solo detectan neutrófilos, sino también subpoblaciones de macrófagos e incluso linfocitos.
Nuestro estudio también demuestra que Ly-6G, reacciona únicamente con  neutrófilos, es un marcador muy útil para detectar específicamente células del linaje de los neutrófilos14. Esto también fue descrito recientemente en un estudio de Tsou et al.31.
Además de la presencia de neutrófilos en la lesión aterosclerótica, probablemente infiltrados a través del endotelio que expresa E-selectina y que recubre la lesión, también se encontraron neutrófilos en la capa adventicia y entre las fibras de la capa media que rodean la lesión. Esto podría indicar dos vías alternativas de entrada de neutrófilos a la lesión.
Moos et al.31 observaron que la infiltración de linfocitos en la adventicia es importante durante la aterogénesis en ratones apoE−/−. Nuestros resultados sugieren que la infiltración de neutrófilos en la adventicia también podría desempeñar un papel clave en la aterogénesis.

EN RESUMEN
Nuestro estudio muestra, por primera vez, la presencia y distribución de neutrófilos positivos para MPO en lesiones ateroscleróticas intermedias y avanzadas en ratones.
Estos datos apuntan a un papel significativo, aunque aún no definido, de los neutrófilos en la progresión de la aterosclerosis.
Esto justifica la realización de más investigaciones sobre el papel fisiopatológico de los neutrófilos en la patología de la aterosclerosis en ratones y humanos.

NOTA: Este es un resumen general de un artículo publicado. El texto completo, las tablas, los gráficos, las figuras y otros detalles se
           encuentran en la revista mencionada al principio.

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