LABORATORIO DE URGENCIAS

 

 

Neutrofilos en Inflamación Aguda

Conceptos Actuales e Implicancias Traslacionales – Revisión

Andreas Margraf,; Clifford A. Lowell,; Alexander Zarbock

Blood (April, 2022), 139 (14): 2130-2144

 

 

Un sistema inmunitario funcional es crucial para combatir los patógenos invasores. Sin embargo, la activación e infiltración descontroladas de células inmunitarias pueden provocar daño orgánico, poniendo en peligro al huésped. Las manifestaciones clínicas o enfermedades asociadas a estas reacciones inmunitarias descontroladas incluyen glomerulonefritis, crisis de dolor relacionadas con la vasooclusión en la enfermedad de células falciformes, daño por isquemia-reperfusión, lesión renal aguda, esteatosis hepática y choque séptico. La sepsis se asocia con una alta mortalidad e implica infiltración y activación descontroladas de células inmunitarias, formación de edema, daño tisular y disfunción orgánica.1,2. Por consiguiente, comprender los pasos reguladores individuales, así como las señales específicas de reclutamiento y activación de las células inmunitarias en diferentes tejidos y contextos inflamatorios, es un requisito previo para desarrollar posibles enfoques terapéuticos.
Los leucocitos están compuestos por diferentes poblaciones celulares, incluyendo granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), monocitos y linfocitos T y B, cada uno con funciones inmunológicas distintas.
Los neutrófilos, el leucocito más abundante, llegan al sitio de la inflamación en cascada, lo que activa funciones efectoras específicas, como la liberación de especies reactivas de oxígeno, la degranulación, la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y la fagocitosis.3-6 Un desequilibrio en el número, el reclutamiento o la funcionalidad de los neutrófilos durante este proceso da lugar a patologías clínicas que incluyen infecciones incontroladas, inmunopatología o autoinmunidad.

PASOS TRADICIONALES DE LA CASCADA DE RECLUTAMIENTO DE LEUCOCITOS

La funcionalidad basada en el efector requiere que los neutrófilos se dirijan con precisión al sitio de la infección. Este proceso se basa en pasos regulados diferencialmente, descubiertos por diversos pioneros en el campo,7-14 que pueden describirse de forma simplificada en cascada, lo que resulta en una infiltración exitosa del órgano.

Captura y rodamiento
Los neutrófilos son células que circulan libremente en el torrente sanguíneo. La focalización localizada hacia la pared del vaso y las interacciones transitorias se manifiestan a través de la reología y la marginación, seguidas de la captura.15,16 La captura (o anclaje) en sí misma se puede separar en 2 pasos independientes, pero estrechamente relacionados: la captura primaria, que implica una interacción directa neutrófilo-endotelial, y la captura secundaria mediada por L-selectina, en la que los neutrófilos interactúan con leucocitos o fragmentos leucocitarios que ya están rodando.17
Posteriormente, el neutrófilo participa en una interacción constante más lenta denominada "rodamiento". Aunque el rodamiento rápido depende crucialmente de la P-selectina endotelial y/o plaquetaria, el rodamiento lento depende de la E-selectina expresada en el endotelio.18-21
El rodamiento involucra sialil-LewisX y el receptor ligando de glicoproteína 1 de P-selectina (PSGL-1) dependiente de la glicosilación expresado en el neutrófilo,22,23 que, después de unirse a E- o La P-selectina puede inducir un cambio conformacional en la integrina, pasando de una afinidad baja a intermedia o incluso alta.24,25 PSGL-1 está ligada al citoesqueleto de actina, lo que facilita los cambios en la polimerización de la actina necesarios para un rodamiento lento. De hecho, se han descrito defectos en la polimerización del citoesqueleto de actina que dan lugar a un rodamiento inadecuado e intermitente.26,27
Al observar leucocitos rodantes a velocidades de cizallamiento muy elevadas, se pueden observar pequeñas formaciones de membrana, denominadas «anclajes» (en la parte posterior) y «lazos» (en la parte anterior), que aumentan la superficie adhesiva de la membrana. Los lazos de membrana presentan zonas con alta expresión de PSGL-1, junto con el antígeno de función leucocitaria 1 (LFA-1), que actúa como sustrato adhesivo, permitiendo el rodamiento incluso a altas velocidades de cizallamiento.28.
Cabe destacar que, si bien los anclajes parecen establecer interacciones más estables, a velocidades de cizallamiento muy elevadas, como en condiciones sépticas, se desprenden de los neutrófilos, formando las denominadas «estructuras alargadas derivadas de neutrófilos» ricas en S100A8/A9.29
Estas estructuras liberan S100A8/A9 al medio, dependiendo de los niveles de calcio, lo que puede promover activamente el entorno inflamatorio en la superficie endotelial.

Activación y adhesión de integrinas.
El rodamiento y la desaceleración celular conducen a la interacción exitosa de los receptores de quimiocinas, como CXCR-2 y los receptores de péptidos formilados, con sus ligandos presentes en el endotelio.³⁰ Esto provoca una respuesta de señalización en múltiples etapas que resulta en el cambio conformacional de las integrinas y permite la adhesión celular resistente al esfuerzo cortante.14,31.
Las integrinas son heterodímeros que constan de una subunidad α y una subunidad β. La clase más prominente de integrinas expresadas por los neutrófilos son las integrinas β2, de las cuales expresan 4 (LFA-1, Mac-1, CR4 y αDβ2) en diversos grados.32-34. Hasta donde sabemos, las integrinas pueden existir en 4 conformaciones, que van desde inactivas (plegadas y cerradas) hasta completamente activas (abiertas). Todas las cascadas de activación de integrinas mediadas por receptores acoplados a proteínas G (señalización de adentro hacia afuera) dan como resultado comúnmente el reclutamiento de reguladores de integrinas, incluyendo talina-1 y kindlina-3, a la cola β citoplasmática de la integrina LFA-1, con participación diferencial de otros moduladores de integrinas, como Rap1, RIAM, ILK y PKC.35-38 Esta activación completa exitosa mediada por quimiocinas da como resultado la conformación de alta afinidad de la integrina. La conformación de alta afinidad de LFA-1 interactúa con su ligando endotelial ICAM-1, lo que detiene el rodamiento lento y fija el neutrófilo a la superficie endotelial.39 Además de la β2-integrina LFA-1, las β1-integrinas antígeno tardío 6 (VLA-6; que se une a las lamininas) y VLA-4 (que se une a VCAM-1) se han relacionado con la adhesión de neutrófilos.40-42 Esta adhesión se refuerza mediante la interacción de la integrina neutrofílica Mac-1 con ICAM-1, un paso que se ve afectado por los componentes de señalización proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASp) y ArhGAP15.43,44

Desplazamiento, transmigración y desplazamiento abluminal
La adhesión de neutrófilos va seguida de un movimiento más lento a lo largo del endotelio denominado "desplazamiento", que puede producirse en la dirección del flujo sanguíneo o en contra de él. El reptación depende de delicados pasos de activación-desactivación de integrinas, moduladores de la vía de activación de integrinas,43 y dinámica del flujo de actina.45 Mac-1 es el principal regulador de la reptación intravascular en ICAM-1 en la microvasculatura.46 Sin embargo, la reptación de neutrófilos en células endoteliales microvasculares cerebrales primarias de ratón está regulada por LFA-1 y Mac-1 que reconocen los ligandos ICAM-1 e ICAM-2, lo que sugiere diferencias específicas de órganos en los patrones de reclutamiento.6,47 Después de la búsqueda activa de neutrófilos de sitios de extravasación, la diapédesis puede ocurrir de manera transjuncional (paracelular) o transcelular. La diapédesis paracelular es la ruta preferida para la salida de leucocitos de la vasculatura. Durante este proceso, los neutrófilos ejercen fuerzas mecánicas sobre las células endoteliales vasculares, lo que provoca la apertura de espacios de unión, seguida de la penetración invasiva del neutrófilo en el espacio abluminal.48
Este proceso se ve potenciado por señales inflamatorias, que facilitan la contractilidad de las células endoteliales, lo que permite el paso de los leucocitos.48 Curiosamente, el factor tisular derivado de mastocitos, como componente de señalización inflamatoria, también contribuye a la extravasación eficiente de neutrófilos en diferentes modelos, como la inflamación cutánea inducida por hipersensibilidad o la inflamación desencadenada por lipopolisacáridos (LPS).49
En general, los neutrófilos parecen favorecer la ruta de menor resistencia en su extravasación, porque exploran la superficie circundante en busca de poros grandes para participar en el reposicionamiento.50 Además de estas señales biomecánicas, el reptación y la transmigración se ven afectados de forma diferencial por un entorno de quimiocinas de CXCL-1 y CXCL-2, ya que CXCL-1 es el principal regulador de la extravasación intravascular y subluminal. La transmigración se produce por reptación, mientras que CXCL-2 y ACKR1 median la transmigración.⁵¹ A la transmigración le sigue una etapa de reptación abluminal, que puede considerarse otra serie de eventos en cascada que, una vez que se atraviesan la membrana basal y la capa de pericito, culmina en la invasión completa del tejido.⁵²

Migración inversa
Cabe destacar que la ruta de extravasación unidireccional descrita anteriormente también es accesible en dirección abluminal a luminal, ya que los neutrófilos son capaces de reingresar al torrente sanguíneo en un proceso denominado “migración transendotelial inversa” (rTEM).53 Este proceso es impulsado por LTB4, elastasa de neutrófilos y Mac-1, que en conjunto conducen a la escisión proteolítica de JAM-C, lo que permite a los neutrófilos reingresar al torrente sanguíneo.54,55 Otros factores reguladores incluyen la activación de la subunidad α del factor hipóxico 1 como regulador negativo y la proteína de unión a ARN inducible por frío como regulador positivo de la rTEM de los neutrófilos.56,57 El paso migratorio inverso depende crucialmente de los gradientes de quimiocinas, ya que la deficiencia del receptor de quimiocinas CXCR2 reduce la rTEM de los neutrófilos.58 En general, la rTEM da como resultado un cambio de fenotipo de los neutrófilos hacia una morfología activada.59 Neutrófilos transmigrados inversamente pueden alojarse en órganos remotos, como el pulmón, lo que provoca fugas vasculares en sitios distantes de la lesión inflamatoria original .60 Cabe destacar que, en el pez cebra, la transmigración inversa también ocurre durante la cicatrización de heridas, que depende al menos parcialmente de la presencia de macrófagos que median la resolución de la infiltración de neutrófilos.61,62 La migración inversa de neutrófilos se ha considerado una piedra angular de la resolución de la inflamación en la cicatrización de heridas.63 Por lo tanto, estos hallazgos podrían implicar que el alojamiento de neutrófilos preactivados en órganos remotos es la consecuencia no deseada de los procesos de resolución continuos/incontrolados, incluida la migración inversa, en los sitios de inflamación.62 Debido a que los neutrófilos necesitan acceder al sistema circulatorio para regresar a la circulación, se deben considerar los factores que alteran los tejidos. De hecho, en un modelo de lesión hepática estéril en ratones, si bien la extravasación primaria de neutrófilos no se vio afectada por la ausencia de catepsina C, la transmigración inversa de neutrófilos dependió crucialmente de la actividad de la serina proteasa, lo que afectó la revascularización del órgano.⁶⁴ Cabe destacar que la transmigración inversa también ocurre en otros subtipos de leucocitos, como los monocitos, y se ha relacionado con diferencias fenotípicas en las células dendríticas maduras (que migraron inversamente) en comparación con los macrófagos (que permanecen y no participan en la transmigración inversa).⁶⁵

Migración tisular
Una vez que el neutrófilo ha atravesado la membrana basal para entrar en el intersticio, participa en una forma diferente de migración "ameboide" que requiere deformación celular, polimerización de actina y reorganización estructural del tejido.⁶⁶ Los mecanismos que regulan la migración intersticial ameboide son distintos de los que controlan la adhesión/migración intravascular. Por ejemplo, la deficiencia de la miosina 1f de clase I no convencional no afecta la migración a lo largo de superficies bidimensionales, como el reptación endotelial, pero sí bloquea la migración exitosa de neutrófilos en redes de colágeno tridimensionales.67 Durante la migración intersticial, los neutrófilos liberan proteasas para degradar elementos de la matriz al tiempo que reposicionan su núcleo, impulsándose hacia adelante a través de poros distintivos de la red de colágeno.68
A diferencia de la reptación intraluminal bidimensional, en la que las serina proteasas controlan las moléculas de adhesión de la superficie celular (p. ej., CD44), las metaloproteinasas de matriz desempeñan un papel dominante en la remodelación tisular durante la migración intersticial.66 No obstante, la migración de neutrófilos en el tejido intersticial también puede ocurrir de manera independiente de las proteasas mediante la polarización persistente hacia atrás de la actina F.69

Funciones efectoras
Una vez que los neutrófilos son reclutados al sitio de la infección, es necesario combatir los patógenos invasores. Para ello, el neutrófilo cuenta con un repertorio de funciones efectoras, como la fagocitosis, la NETosis, la producción de especies reactivas de oxígeno y la secreción de gránulos. Estas funciones efectoras pueden ser inducidas por la transmigración de neutrófilos, en la que adoptan un fenotipo preactivado.70,71 Los reguladores de la señalización de integrinas (por ejemplo, la fosfoproteína 2 asociada a la cinasa Src) que modulan la activación de integrinas de adentro hacia afuera afectan igualmente las respuestas de señalización de afuera hacia adentro (por ejemplo, la fagocitosis de partículas bacterianas), lo que enfatiza la doble contribución de las integrinas y los reguladores de integrinas al reclutamiento y las funciones efectoras.72 Como otro elemento de señalización, el transporte de calcio juega un papel importante en la fagocitosis eficiente, porque la ausencia del sensor de calcio STIM1 disminuye significativamente la fagocitosis de partículas de Staphylococcus aureus.73 Una observación bastante sorprendente es el efecto del desprendimiento de L-selectina, que ocurre regularmente durante la activación de los neutrófilos, sobre las funciones efectoras mediadas de afuera hacia adentro. Aquí, la liberación de L-selectina mediada por ADAMTS17 mejora la fagocitosis, la eliminación bacteriana y la navegación tisular de los neutrófilos en el tejido infectado.74 Además de esta respuesta directa de "ingestión" hacia las partículas bacterianas, se necesita otro componente efector, las NET, para combatir y atrapar patógenos invasores, como lo demuestra el uso de un nuevo anticuerpo monoclonal que protege las NET de la degradación y que mejora el resultado en modelos preclínicos de sepsis.75 Asimismo, las enfermedades inflamatorias estériles, como la artritis reumatoide, la lesión hepática y el daño renal, se ven afectadas por las NET, ya que la NETosis excesiva puede provocar daño orgánico.76-78

FACTORES GENERALES QUE INFLUYEN EN LA FUNCIONALIDAD DE LOS NEUTRÓFILOS Y LA INFLAMACIÓN

Propiedades específicas de los órganos y poblaciones de neutrófilos
A lo largo de los años se han descubierto patrones de reclutamiento de neutrófilos específicos de cada órgano.79, 80, 81, 82 Los diferentes órganos presentan propiedades reológicas y celulares distintas. y propiedades de los receptores. Por ejemplo, el pulmón y el hígado presentan el receptor recientemente identificado dipeptidasa-1, que influye en el secuestro de leucocitos y en el resultado de la inflamación pulmonar relacionada con la endotoxemia.83 Curiosamente, el riñón también presenta patrones de reclutamiento distintos, porque el reclutamiento de neutrófilos al glomérulo no implica un rodamiento previo de los neutrófilos, sino una detención inmediata debido a la P-selectina plaquetaria.84 Es tentador especular sobre posibles terapias que sean capaces de bloquear los receptores específicos de órganos responsables de la infiltración de neutrófilos, lo que permitiría dirigir estas células inflamatorias a un sitio de infección, lejos, por ejemplo, de los órganos lesionados por isquemia-reperfusión. Se sabe además que los principales sitios de interacción de neutrófilos, como el pulmón, presentan "reservorios" de neutrófilos y patrones de reclutamiento basados ​​en capilares.85 Por lo tanto, aunque se sabe que la infiltración de neutrófilos afecta la función de los órganos, la célula en sí también está modulada por su tejido circundante. Corroborando esta idea, Ballesteros et al. demostraron recientemente, de forma elegante, que los fenotipos de los neutrófilos, incluida su longevidad, difieren según sus tejidos diana.⁸⁶

Heterogeneidad de los neutrófilos y ritmicidad circadiana
Aunque originalmente se describieron como una población homogénea, ahora se acepta que existen diferentes subtipos de neutrófilos, lo que subraya la importancia de la heterogeneidad de los neutrófilos para los resultados relacionados con las enfermedades.⁸⁷ Si bien el debate sobre el origen de estas características fenotípicas distintivas continúa,⁸⁸ parece que factores intrínsecos y extrínsecos contribuyen a la diversidad de los neutrófilos. Un factor interno prominente es el gen del reloj circadiano Bmal1. Este factor actúa como un reloj interno, afectando los procesos dependientes de CXCL2/CXCR2 y contrastando los procesos dependientes de CXCR4 asociados con el envejecimiento de los neutrófilos y su eliminación de la circulación.89 Además, las características circadianas externas y las propiedades dependientes del tejido afectan a los neutrófilos, porque la eliminación de la circulación se ve afectada por las oscilaciones de moléculas interactivas, como P-/E-selectina y VCAM-1, en la microvasculatura de la médula ósea.90, 91
Aunque los ritmos circadianos, en general, se conocen desde hace mucho tiempo,92, 93 y las observaciones clínicas resaltan la variabilidad horaria en las enfermedades inflamatorias. Las presentaciones,94, 95, 96 los enfoques terapéuticos y clínicos (ejemplo, la programación de cirugías /intervenciones)   que incorporan este conocimiento siguen siendo escasos.97

Interacción celular que afecta a los neutrófilos
La interacción de los neutrófilos con las células endoteliales es crucial para su activación y reclutamiento, pero otras células también influyen en las respuestas de los neutrófilos. Los neutrófilos son capaces de interactuar directamente con plaquetas, megacariocitos, otros leucocitos, células tumorales y eritrocitos en diversos grados, dependiendo del modelo subyacente (de enfermedad).98, 99, 100, 101 Aunque la interacción directa entre eritrocitos y neutrófilos ocurre principalmente en la enfermedad de células falciformes, se atribuye a las plaquetas un papel más prominente en la interacción con los neutrófilos, "guiándolos" a los sitios de extravasación.102 La depleción de plaquetas protege a los ratones de la lesión pulmonar en varios modelos.103, 104 No obstante, la trombocitopenia en sí misma está relacionada con un mayor riesgo de síndrome de dificultad respiratoria aguda.105 Además, en el hígado, las plaquetas ayudan en el reclutamiento de neutrófilos a sitios de lesión estériles, un proceso que es crucial para la reparación de órganos.106 Además de las plaquetas, los neutrófilos interactúan directamente con las células T, específicamente con las células T reguladoras, que, una vez estimuladas con LPS, provocan la producción de interleucina-10 en Neutrófilos.107

Pericitos en la regulación de la invasión de neutrófilos e inflamación
La emigración de neutrófilos se ve afectada por las células endoteliales, y los pericitos también contribuyen de manera clave a la invasión tisular eficiente de los neutrófilos.108
Se sabe desde hace más de una década que las regiones/puntos calientes de baja expresión dentro de la membrana basal son sitios preferidos para la emigración de neutrófilos.109 Estas regiones de baja expresión se alinean con los espacios de los pericitos y ambos pueden agrandarse en una medida similar, controlando la invasión de neutrófilos.109, 110 Los neutrófilos interactúan con los pericitos de manera dependiente de ICAM-1 mediante la formación de extensiones que conducen a interacciones con extensiones basadas en pericitos,111 pero existen informes contradictorios que cuestionan la necesidad de la interacción de neutrófilos para el agrandamiento de los espacios.110, 112 La contractilidad de los pericitos, que se ha atribuido a la regulación de la permisividad de la invasión de neutrófilos, se ve afectada por la inhibición de macrófagos secretada por las células endoteliales. factor, mostrando la interacción mecanicista de la barrera hemato-tisular durante la emigración de neutrófilos.113 Subconjuntos distintos de pericitos, como los pericitos NG2+, que se pueden encontrar cerca de arteriolas y capilares, muestran características de expresión únicas, ofreciendo sensores inflamatorios, como el receptor del factor de necrosis tumoral, los receptores tipo Toll y el receptor de péptido formilado 2.
Estos pericitos conducen a una mayor velocidad migratoria y a características invasivas alteradas (incluida la regulación de las metaloproteinasas de matriz) de los neutrófilos por el factor inhibidor de macrófagos y CXCL8.114.
Aunque los pericitos son bien conocidos por su contribución a la regulación de la invasión de neutrófilos, los esfuerzos terapéuticos siguen siendo escasos y requieren más investigación mecanicista.

Consideraciones traslacionales.
Es necesario realizar una evaluación adecuada de los neutrófilos presentes, el grado y la necesidad de reacciones inflamatorias, y la evaluación de posibles tratamientos. (B)
La disfunción leucocitaria se observa en enfermedades genéticas.
Las deficiencias en la adhesión leucocitaria aumentan el riesgo de infecciones por diversas causas subyacentes.
Asimismo, se conocen otras causas que afectan a los neutrófilos, como la transfusión, la circulación extracorpórea y las enfermedades inflamatorias. Los pacientes requieren aislamiento y medidas inmunoprotectoras o un control adecuado de la hiperactivación de los neutrófilos y estrategias de protección orgánica. (C) Las consideraciones relacionadas con la COVID-19 deben tener en cuenta los fenotipos de los neutrófilos.
Se están debatiendo estrategias antiinflamatorias, pero se necesitan intervenciones más precisas.
Es importante distinguir entre las fases aguda y prolongada de la COVID-19. Los enfoques dirigidos parecen prometedores para futuros esfuerzos en el tratamiento de la COVID-19, la sepsis o el síndrome de dificultad respiratoria aguda. (D)
La consideración del ritmo circadiano resulta crucial para futuros esfuerzos terapéuticos. Es necesario reprogramar cirugías o intervenciones, y se han implementado cronoterapia, fototerapia e intervenciones para mejorar el sueño. CPB: circulación extracorpórea; ECMO: oxigenación por membrana extracorpórea; IgE: inmunoglobulina E; WAS: síndrome de Wiskott-Aldrich.

RESUMEN Y CONCLUSIONES

En resumen, el reclutamiento de neutrófilos depende de una secuencia multifactorial específica que requiere selectinas, integrinas, ligandos accesibles, un entorno de quimiocinas adecuado, interacciones célula-célula y diferentes cascadas de señalización celular.
La evidencia actual demuestra que el reclutamiento de leucocitos, descrito previamente como unidireccional, es en realidad bidireccional, permitiendo que los neutrófilos reingresen a la circulación y causen daño orgánico, incluso en zonas remotas del organismo.
La regulación de cada paso para la infiltración exitosa de neutrófilos se ve crucialmente afectada por las integrinas y los gradientes de quimiocinas. El reclutamiento, el número y los fenotipos de los neutrófilos se ven afectados por las quimiocinas y citocinas circulantes, y el consumo, la reproducción y la movilización de las poblaciones de neutrófilos también deben considerarse al interpretar la magnitud total de dichas poblaciones.
Por lo tanto, parece que aún estamos al borde de comprender la compleja interacción entre la inflamación, los factores estresantes, la resolución y las diversas funciones que ejercen los neutrófilos.
Se necesita investigación futura para optimizar las opciones de diagnóstico de las subpoblaciones de neutrófilos, y son cruciales los ensayos clínicos aleatorizados a gran escala para abordar las terapias inmunomoduladoras individualizadas para subgrupos específicos de pacientes.

NOTA: Este es un extenso resumen general de un artículo publicado. El texto completo y las referencias, tablas, gráficos, figuras y más
           detalles se pueden encontrar en la revista mencionada al principio.

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