LABORATORIO DE URGENCIAS

Reversión del Envejecimiento Químico de Proteínas Mediante Glicación Enzimática.

Marisa Trabosh, Jason Smith, Aaron Cravens et al

Nature Communications, July (2026); Vol 17; Article Number:5926

Una característica distintiva del envejecimiento en mamíferos es la acumulación persistente de daño químico en las proteínas de la matriz extracelular (MEC)¹. Los productos finales de glicación avanzada y lipoxidación (AGE), formados por la reacción no enzimática de carbonilos reactivos derivados de azúcares y lípidos con aminoácidos, destacan por su abundancia y efectos patógenos²,³,⁴. Numerosas evidencias indican que estos aductos abundantes no son meros biomarcadores pasivos, sino mediadores activos de las morbilidades relacionadas con la edad²,³,⁴. Por ejemplo, la acumulación de AGE contribuye al endurecimiento y la pérdida de elasticidad observados en los tejidos envejecidos al entrecruzar el colágeno e inhibir el recambio proteico normal⁵,⁶. Además, los AGE promueven la inflamación crónica al actuar como neoepítopos que activan el sistema inmunitario adaptativo⁷ y al activar el sistema inmunitario innato a través del receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE)⁸. Entre el heterogéneo grupo de AGEs, la Nε-carboximetil-lisina (CML) ha surgido como un aducto crítico y químicamente estable que se encuentra abundantemente en proteínas de larga vida durante el envejecimiento2,9,10. Más allá del daño estructural, impulsado por la conversión de residuos de lisina catiónicos en aductos de carboximetilo aniónicos, la CML ejerce efectos nocivos a través de la señalización celular, actuando como ligando específico para RAGE11,12. La activación del eje CML-RAGE desencadena una cascada de señalización que activa el NF-κB y estimula la liberación de citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento profibróticos13,14,15,16. En el contexto del sistema nervioso central, la acumulación de CML se ha relacionado con el estrés oxidativo y el daño mitocondrial en la microglía, lo que altera aún más la homeostasis cerebral durante el envejecimiento13. A pesar de la asociación entre la acumulación de CML y la disfunción tisular, las estrategias terapéuticas para revertir esta modificación siguen siendo difíciles de encontrar. Un objetivo de larga data en los campos de la diabetes, la biología vascular y el envejecimiento ha sido ralentizar o revertir la acumulación de AGEs en el organismo17,18. Existen redes de desintoxicación endógena, como el sistema de glioxalasa (Glo1), que eliminan precursores dicarbonílicos reactivos como el metilglioxal, pero no revierten los aductos estables de AGE una vez formados en las proteínas19. Las intervenciones farmacológicas, como la aminoguanidina y el alagebrium, han demostrado su capacidad para inhibir la formación al atrapar o descomponer intermediarios reactivos20. Si bien esta estrategia puede reducir la formación de nuevos AGEs, no aborda la importante reserva de AGEs preexistentes que se han acumulado durante décadas, y estos enfoques no restauran la estructura nativa de la proteína.
Aquí describimos el desarrollo de CMLase, una enzima diseñada para revertir específicamente las modificaciones de CML formadas en sustratos proteicos. Mediante cribado computacional y evolución dirigida, diseñamos la glicina oxidasa para oxidar CML y restaurar la lisina nativa. Demostramos que la CMLase revierte las modificaciones de CML en proteínas modelo, así como en tejidos humanos envejecidos que acumulan una cantidad considerable de AGE. Este trabajo establece que el daño a las proteínas envejecidas, que antes se consideraba irreversible, puede repararse enzimáticamente, sentando las bases para el desarrollo de intervenciones dirigidas a los mecanismos moleculares subyacentes al envejecimiento humano.

RESULTADOS

El análisis estructural identifica un andamiaje de glicina oxidasa accesible a sustratos peptídicos.
No se ha descrito en la literatura ninguna enzima que escinda CML con actividad sobre péptidos y proteínas. Para diseñar un biocatalizador capaz de realizar esta reparación, buscamos identificar un punto de partida adecuado que escindiera tanto CML libre como peptidil-CML. Consideramos que un punto de partida suficientemente activo podría mejorarse mediante evolución dirigida para obtener una enzima de escisión de proteína-CML altamente activa. Primero, examinamos la literatura en busca de informes sobre actividad enzimática sobre CML. Un estudio aisló y caracterizó parcialmente una flavoenzima con actividad de CML oxidasa en un lisado celular de un moho del suelo Cladosporium²¹. Desafortunadamente, no pudimos identificar la enzima descrita, ya que no se proporcionó información sobre la secuencia de ADN o proteína, el aislado original de Cladosporium no estaba disponible (comunicación personal) y encontramos que el lisado celular de un aislado comercial de Cladosporium era inactivo sobre CML y peptidil-CML. Por lo tanto, buscamos identificar un punto de partida alternativo. Identificamos la enzima glicina oxidasa dependiente de FAD como candidata para la escisión de CML basándonos en la similitud química entre la porción carboximetil-amino de CML y la glicina22. Se informó que una glicina oxidasa candidata de Bacillus subtilis tenía actividad sobre una variedad de derivados N-alquílicos de glicina, lo que sugiere que el sitio activo podría acomodar sustratos más voluminosos como CML23. Producimos recombinantemente glicina oxidasa de B. subtilis (BsGO) y observamos actividad sobre CML libre con lisina, ácido glioxílico y peróxido de hidrógeno producidos como productos. BsGO mostró una actividad inespecífica, con una eficiencia catalítica sobre CML (kcat/KM = 8,6 × 10⁻³ s⁻¹ mM⁻¹) aproximadamente treinta veces menor que sobre su sustrato nativo, la glicina (kcat/KM = 0,24 s⁻¹ mM⁻¹).
Sin embargo, BsGO no mostró actividad detectable al ser ensayada frente a sustratos de peptidil-CML. Este resultado nos impulsó a buscar puntos de partida alternativos que presentaran actividad inicial frente a peptidil-CML o que demostraran una mayor actividad inicial frente a CML libre.
Iniciamos el cribado de homólogos de BsGO para identificar un mejor punto de partida para la ingeniería enzimática. Seleccionamos dieciséis secuencias para evaluar frente a CML y peptidil-CML. De estas, trece homólogos de BsGO se produjeron con éxito en forma soluble. Cabe destacar que ocho de estas enzimas mostraron actividad medible sobre CML libre, lo que sugiere una considerable promiscuidad de sustrato o que algunas enzimas anotadas como glicina oxidasas podrían estar mal anotadas. Ninguna de las enzimas tuvo actividad detectable sobre peptidil-CML. Cabe destacar que la glicina oxidasa de Bacillus sp. 1NLA3E (Bs1GO) mostró un valor de KM tres veces menor para CML (2,6 mM) en comparación con BsGO (8,2 mM). La comparación de la estructura cristalina de BsGO con un modelo AlphaFold de Bs1GO24 mostró que ambas enzimas tienen un sitio activo similar; sin embargo, diferencias clave como His244,BsGO → Gly244,Bs1GO muestran una tendencia hacia residuos más pequeños en el sitio activo.
Razonamos que la presencia de cadenas laterales de aminoácidos más pequeñas en el sitio activo de Bs1GO podría permitir una mejor acomodación de CML en comparación con el sitio activo de BsGO. El modelado de CML en el sitio activo de Bs1GO reveló características estructurales de la enzima que probablemente bloqueaban el acceso de los sustratos peptídicos de CML al sitio activo (Fig. 1C).
Dada la alta frecuencia de actividad promiscua de CML entre las glicina oxidasas anotadas, buscamos un homólogo de GO con una estructura secundaria mínima que obstruyera el acceso al sitio activo. Utilizando UniProt, seleccionamos todas las secuencias anotadas como glicina oxidasa o aminoácido oxidasa que también contaban con una estructura AlphaFoldDB disponible²⁵. Esta búsqueda arrojó 44 783 secuencias. Posteriormente, realizamos alineamientos estructurales por pares con Bs1GO, buscando específicamente enzimas que presentaran una deleción de diez o más aminoácidos en la región de la hélice α9. Se identificaron menos de cincuenta secuencias únicas que cumplían este criterio, y experimentalmente identificamos una glicina oxidasa de Calidithermus roseus (CrGO) que mostró actividad detectable sobre un sustrato peptidil-CML (AA-CML-AA). En comparación con Bs1GO, CrGO presentaba una deleción de veinte aminoácidos cerca del sitio activo. Esta deleción incluía la ausencia total de la hélice de doce aminoácidos (α9), lo que, según nuestra interpretación, facilita el acceso a sustratos de mayor tamaño. Debido a la actividad notablemente baja de CrGO sobre el peptidil-CML (kcat/KM = 1,2 × 10⁻³ s⁻¹ mM⁻¹), nuestro objetivo era desarrollar una estrategia de ingeniería para mejorar su actividad frente a sustratos peptídicos.

La selección genética permite la ingeniería de una proteína CMLasa altamente activa.
Para aumentar la actividad de la peptidil-CML oxidasa de CrGO, desarrollamos una estrategia de selección genética de alto rendimiento. Las selecciones genéticas permiten el cribado rápido de grandes bibliotecas de ADN (>10⁸ miembros) para identificar variantes enzimáticas raras con las actividades deseadas, lo que ofrece ventajas sobre los enfoques de cribado más limitados.²⁶ Primero desarrollamos una selección genética para la actividad de la CML oxidasa acoplando el crecimiento de una cepa auxótrofa de lisina de E. coli a la actividad de la CML oxidasa, que produce lisina a partir de CML libre. Posteriormente, adaptamos la selección con CML libre para desarrollar una selección que permitiera identificar variantes enzimáticas con actividad sobre la peptidil-CML. La selección con peptidil-CML utilizó un sustrato peptídico lo suficientemente pequeño (siete aminoácidos) como para entrar en el periplasma, pero demasiado grande para ser transportado al citoplasma, lo que garantizaba que el péptido no fuera degradado por peptidasas intracelulares. Se fusionaron variantes de la oxidasa de CML a un péptido señal N-terminal para localizar la enzima en el periplasma, donde las variantes activas convierten el peptidil-CML en peptidil-lisina. Posteriormente, la tripsina, localizada en el periplasma, escinde el residuo de lisina recién formado, generando fragmentos peptídicos más pequeños que se transportan al citoplasma. Estos pequeños péptidos se proteolizan en la célula, lo que permite el crecimiento del auxótrofo de lisina. Validamos la selección demostrando que el crecimiento en peptidil-CML dependía de la presencia de una oxidasa de CML con actividad sobre este compuesto. Con una selección funcional establecida, buscamos evolucionar CrGO hacia una enzima altamente activa para escindir las modificaciones de CML en péptidos y proteínas.
Primero nos centramos en mejorar la actividad de la enzima sobre CML libre, seleccionando las colonias de crecimiento más rápido y evaluando las variantes con mayor actividad sobre CML y peptidil-CML. En la primera ronda de evolución, construimos una biblioteca de variantes mediante PCR con propensión a errores. La biblioteca se evaluó en cuanto a su actividad tanto en la selección con CML libre como con peptidil-CML. Si bien ninguna variante demostró actividad en la selección con péptido, incluso en condiciones permisivas (1 mM de péptido y siete días de crecimiento), la selección con CML libre produjo una capa de colonias. Para aislar las variantes más mejoradas, aumentamos la rigurosidad de la selección reduciendo las concentraciones de IPTG (20 μM) y CML (100 μM) y seleccionando únicamente las colonias que aparecieron en un plazo de dos días. Este proceso dio como resultado la variante CrGO-764, que presentaba siete mutaciones de aminoácidos (A35T, P87S, V129A, R141C, M194I, F195C, G243R) y mostró una mejora de cinco veces en su actividad sobre peptidil-CML. El análisis de un modelo de homología de CrGO-764 reveló dos bucles no estructurados (Bucles 1 y 2) que obstruían parcialmente la apertura del sitio activo y potencialmente dificultaban el acceso al sustrato. Por lo tanto, en la segunda ronda de evolución, nos centramos en estos bucles.
Se generaron bibliotecas para aleatorizar secuencias en cada bucle e introducir deleciones de uno a cuatro aminoácidos. La selección de crecimiento indicó que las deleciones en el bucle 1, específicamente las reducciones de uno y dos aminoácidos, produjeron variantes funcionales en condiciones permisivas de CML libre. Los intentos de realizar deleciones mayores en el bucle 1 o modificaciones en el bucle 2 dieron como resultado enzimas no funcionales. Se identificó una variante altamente activa (CrGO-785) que contenía una sustitución de aminoácido (H49W) y una deleción de dos aminoácidos (Ala50 y Glu51) en el bucle 1. CrGO-785 mostró una afinidad mejorada por el peptidil-CML y un crecimiento notablemente mejorado en la selección.
A continuación, creamos bibliotecas dirigidas al sitio activo de CrGO-785 guiadas por un homólogo de GO de Candidatus Eremiobacteraeota (CeGO) que mostró una afinidad mucho mayor por CML libre (KM,CeGO = 0,059 mM, KM,CrGO-785 = 0,94 mM). Razonamos que si pudiéramos imitar los residuos en lo profundo del sitio activo que interactúan fuertemente con la cadena lateral de CML, sin cambiar los residuos en la superficie que podrían restringir el acceso de sustratos peptídicos más grandes, podríamos aumentar la afinidad de CrGO-785 por los sustratos peptídicos de CML. La comparación estructural de CeGO y CrGO reveló una alta conservación de la mayoría de los aminoácidos de la primera capa en el bolsillo de unión del sustrato con cinco diferencias clave; Arg60,CeGO → Ala61,CrGO, Asp143,CeGO → Gly112,CrGO, Arg232,CeGO → Cys195,CrGO, Asp235,CeGO → Ala198,CrGO y Glu252,CeGO → Gln214,CrGO. Aleatorizamos simultáneamente los cinco sitios en CrGO-785 y utilizamos la selección genética libre de LMC para aislar las variantes más activas. Los resultados de la selección revelaron un conjunto de mutaciones consensuadas en el parental CrGO-785 en tres sitios (A61G, A198S y Q214K). La nueva variante, CrGO-794, mostró una eficiencia catalítica tres veces mayor sobre CML libre (kcat/KM = 0,023 s⁻¹ mM⁻¹) y una mejora del 50 % en la actividad sobre peptidil-CML. Observamos que algunos compuestos seleccionados para CML libre no mostraron mejoras en la actividad enzimática. Planteamos la hipótesis de que las sustituciones de aminoácidos en estos compuestos conferían mejoras en la estabilidad enzimática, lo que les otorgaba una ventaja en la selección. Para comprobar esta hipótesis, se combinaron variantes con potencial estabilizador de la enzima mediante sustituciones de uno o dos aminoácidos sobre CrGO-794. Caracterizamos la termoestabilidad y la actividad peptídica de estas enzimas e identificamos una variante (CrGO-865) con dos sustituciones adyacentes al sitio activo (L83I, S85T) que resultó en mejoras en la termoestabilidad y la eficiencia catalítica. Luego, buscamos aumentar la actividad peptidil-CML en CrGO-865 mediante la construcción de una biblioteca de PCR propensa a errores y la identificación de variantes mejoradas en la selección de peptidil-CML. Para evitar el sesgo enzimático hacia secuencias peptídicas específicas, pusimos a prueba la biblioteca para el crecimiento en mezclas de péptidos de polialanina que contenían diecisiete aminoácidos diferentes (X) adyacentes a la modificación interna de CML (AAX-CML-AA-CML y AA-CML-XAA-CML). En estas condiciones, solo sobrevivieron las células que expresaban variantes de CML oxidasa capaces de oxidar CML y tolerar la variación en los residuos que flanquean el sitio CML. A partir de esta selección, identificamos la variante CrGO-897, que contiene tres mutaciones (E80Q, H226A, H230R) y exhibe una mejora del 20% en la eficiencia catalítica sobre el péptido. CrGO-897 mantuvo una alta especificidad por el grupo carboximetilamino de la glicina y la CML: no oxidó otros aminoácidos canónicos, ni la glicina o arginina situadas en los extremos de los sustratos tripéptidos, y no mostró actividad sobre sustratos proteicos de carboximetilarginina (CMA).
En resumen, tras cinco rondas de evolución dirigida, desarrollamos una CMLasa altamente activa (CrGO-897) con quince sustituciones de aminoácidos y la eliminación de dos aminoácidos en comparación con la enzima CrGO original.
A continuación, evaluamos la actividad de la CMLasa sobre la albúmina sérica bovina modificada con CML (CML-BSA), una proteína transportadora de AGE de uso común. La CML-BSA se preparó siguiendo protocolos establecidos²⁷ y demostramos que la CMLasa cataliza la oxidación específica de las modificaciones de CML unidas a proteínas. La incubación de CMLase (5 µM) con CML-BSA (1 µM de proteína) produjo peróxido de hidrógeno a una velocidad de 0,90 µM/h. No se detectó peróxido de hidrógeno en las reacciones de control sin CMLase ni cuando la enzima se incubó con BSA no modificada. Para confirmar que la desglucosación observada reflejaba la eliminación de CML de la proteína intacta y no una degradación proteolítica, analizamos los productos de la reacción mediante SDS-PAGE y Western blot. El análisis SDS-PAGE mostró que la proteína permaneció intacta tras la incubación nocturna con CMLase, sin evidencia de fragmentación, y el Western blot, utilizando un anticuerpo anti-CML, mostró una reducción dependiente de la enzima en la señal de CML-BSA.
Cabe destacar que cada ronda de evolución enzimática produjo mejoras en la actividad sobre CML-BSA, a pesar de que las selecciones se realizaron utilizando únicamente sustratos de CML libre y peptidil-CML.

La CMLase revierte eficazmente las modificaciones de CML en una amplia gama de andamios proteicos.
Fisiológicamente, la CML se produce en los residuos de lisina expuestos al solvente de las proteínas de la matriz extracelular (MEC) de larga vida, particularmente en la membrana basal de tejidos como el ojo28, la piel2, el riñón y la pared vascular29,30, donde interrumpe la señalización entre la MEC y las células y promueve la inflamación mediante interacciones con RAGE12. Para evaluar el potencial de la CMLase para aceptar sustratos proteicos fisiológicamente relevantes, evaluamos su actividad in vitro en un panel de proteínas fisiológicamente relevantes, incluyendo caseína, hemoglobina, colágeno y un extracto proteico total de retina (TPE ocular) de oveja. Se utilizó un ensayo ELISA de CML para medir los niveles de CML en cada muestra y se confirmó la especificidad del anticuerpo anti-CML comparando CML-BSA con BSA no modificada. El tratamiento de proteínas modificadas con CML mediante CMLase (5 µM, durante la noche) produjo reducciones significativas en las señales de CML detectadas por ELISA, que oscilaron entre el 52 % y el 97 %. Estos datos demuestran que CMLase elimina eficazmente la mayoría de las modificaciones de CML en los sustratos proteicos detectables por ELISA. La variación en la cantidad de CML eliminada entre los sustratos proteicos probablemente se deba a la variabilidad en la accesibilidad de la cadena lateral de lisina y al contexto estructural local.
Para confirmar que la eliminación de CML detectada por ELISA se debe efectivamente a la actividad catalítica de CMLase, incluimos un control enzimático catalíticamente inactivo (CeGO-763), que no mostró una reducción significativa en la señal de CML detectada por ELISA. Es importante destacar que estos resultados de ELISA fueron reproducibles en diferentes grados de modificación por CML, lo que refuerza la robustez de nuestros datos.
A continuación, evaluamos la actividad de reparación específica del sitio de CMLase mediante proteómica para mapear la presencia de modificaciones de CML en BSA. La CMLase pudo actuar sobre la mayoría de los sitios modificados: de los treinta y tres residuos de lisina modificados por CML detectados mediante proteómica, treinta mostraron niveles reducidos de CML tras el tratamiento con CMLase. Cabe destacar que veintiún sitios presentaron reducciones superiores al 50%, y siete sitios mostraron reducciones superiores al 90%. La actividad de la CMLase en un sitio particular no dependía estrictamente de la accesibilidad a la superficie. Por ejemplo, las lisinas K51, K232 y K573 se encuentran en hélices expuestas a la superficie, pero mostraron reducciones de CML variables del 90%, 38% y 0%, respectivamente. La actividad se correlacionó débilmente con la flexibilidad local de la proteína (factor B), lo que sugiere que la flexibilidad puede ser necesaria, pero no suficiente para la catálisis. Se observó cierta preferencia de secuencia local, con la CMLase mostrando mayor actividad en sitios con cisteínas vecinas y menor actividad en sitios seguidos de regiones hidrofóbicas. Estas tendencias sugieren que la CMLase podría favorecer los sitios más hidrofílicos y accesibles al disolvente dentro del entorno estructural de la BSA. Si bien la mayoría de los sitios expuestos en la superficie se redujeron, tres lisinas fuertemente modificadas (K131, K504, K573) mostraron una reducción inferior al 5%, lo que probablemente contribuyó a la señal ELISA residual observada en la CML-BSA tratada con CMLase. La actividad enzimática reducida se asoció con residuos hidrofóbicos o aromáticos voluminosos (p. ej., F, W, L, V) en la región inmediatamente adyacente, un indicador potencial de accesibilidad reducida, ejemplificado por sitios resistentes como K154, K528 y K573.
Es importante destacar que, si bien la CMLase actúa de forma generalizada en la mayoría de los sitios modificados, se espera que ciertas modificaciones de AGE sean más patógenas según la proteína y el contexto de la enfermedad. Por lo tanto, dirigirse a residuos clave en puntos críticos, en lugar de eliminar completamente la modificación, podría ser suficiente para restaurar la función proteica14,31,32,33. Futuros esfuerzos de ingeniería podrían refinar la especificidad de la CMLase para centrarse selectivamente en estos sitios críticos. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la CMLase revierte eficazmente las modificaciones de CML en una variedad de proteínas fisiológicamente relevantes y es activa en la mayoría de los sitios expuestos en la superficie.

La CMLase revierte la acumulación endógena de CML en tejidos humanos envejecidos.
A continuación, buscamos evaluar la capacidad de la CMLase para revertir las modificaciones de CML formadas endógenamente. La acumulación de CML ocurre predominantemente en organismos longevos, lo que hace que los modelos animales de vida corta no sean adecuados para estudiar la acumulación de este AGE. Por lo tanto, probamos la CMLase directamente en tejidos humanos donde la CML se ha acumulado durante décadas. Aquí demostramos que la CMLase revierte la mayoría de las modificaciones de CML producidas endógenamente en el cristalino, la piel y el tejido arterial humanos.
Las cristalinas del cristalino se encuentran entre las proteínas de mayor longevidad en el cuerpo humano, lo que las hace susceptibles a la acumulación de CML. Se homogeneizó tejido del cristalino de un donante de 64 años y las fracciones de proteínas solubles se incubaron durante la noche con CMLase (5 µM). La evaluación proteómica de las cristalinas del cristalino resultó compleja debido a la heterogeneidad proteica; por lo tanto, el contenido total de CML se evaluó hidrolizando las muestras y midiendo la CML mediante un método de adición estándar LC-MS/MS34. Sorprendentemente, la CMLase redujo la concentración total de modificaciones de CML en las proteínas del cristalino en un 45 % en comparación con las muestras de control no tratadas. La reducción del contenido de CML se validó mediante un ELISA de CML que mostró una reducción del 78 % en el contenido total de CML en las muestras tratadas con CMLase en comparación con las muestras de control no tratadas. La diferencia en la reducción de CML mediante ELISA (78 %) en comparación con LC-MS/MS (45 %) es consistente con la mayor accesibilidad a la CML inmunológicamente detectable expuesta en la superficie que la CML total, que puede incluir residuos internos.
Luego examinamos la capacidad de la CML para revertir la CML acumulada fisiológicamente directamente en tejidos humanos intactos. Se realizó tinción inmunohistoquímica (IHQ) para CML en secciones de aorta abdominal y piel humanas, fijadas en formalina e incluidas en parafina, de donantes de entre 20 y 75 años. Se omitieron los pasos de recuperación de antígeno para evitar la formación de novo de modificaciones de CML inducidas por calor.29 Se evaluaron varios anticuerpos anti-CML comerciales en cuanto a su rendimiento de tinción y especificidad. Si bien todos los anticuerpos probados mostraron reactividad, la inhibición competitiva con el antígeno CML-BSA confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-CML 6D12 (Cosmo Bio) es altamente específico para CML. En consecuencia, se utilizó 6D12 para todos los experimentos de IHQ posteriores. De acuerdo con la literatura, observamos una tinción de IHQ dependiente de la edad para CML en tejido arterial humano29. El tejido arterial de donantes de 20 a 25 años carecía de tinción específica de las modificaciones de CML con el anticuerpo anti-CML; mientras que el tejido arterial de un donante de 75 años mostró una tinción intensa, especialmente a lo largo de la pared arterial y adyacente a las lesiones ateroscleróticas. Por lo tanto, nuestro protocolo de IHQ muestra especificidad para CML y un aumento esperado en la tinción de CML en tejido humano envejecido.
Luego evaluamos la capacidad de CMLase para revertir CML en arterias y piel incubando secciones de tejido durante la noche con CMLase (5 μM) o una enzima de control inactivada (CeGO-763), seguido de tinción de IHQ de las modificaciones de CML. Todas las secciones tratadas con CMLase mostraron una reducción visualmente aparente en la tinción específica de CML después del tratamiento con CMLase. La tinción de CML se cuantificó analizando la intensidad de DAB en cuatro subregiones alineadas espacialmente, y se observó que el tratamiento con CMLase redujo el contenido de CML en más del 70 % en el tejido arterial de personas mayores.
En la piel humana de personas mayores, el tratamiento con CMLase produjo una reducción de más del 55 % en la tinción de CML en las capas epidérmica y dérmica, y revirtió los niveles de tinción de CML a valores inferiores a los encontrados en la piel de personas de 31 años. En conjunto, estos datos resaltan el potencial de CMLase para reparar el daño de CML formado fisiológicamente en diversos tipos de tejido y sustratos proteicos.

DISCUSIÓN

Nuestro trabajo aborda un desafío de larga data en la biología del envejecimiento al demostrar la reversión enzimática del envejecimiento químico de proteínas mediante una deglicosasa modificada genéticamente. Históricamente, la CML se ha clasificado como un producto final de glicación avanzada (AGE) químicamente estable e irreversible³⁵. Como resultado, se acumula en proteínas de larga vida, alterando la integridad estructural de la matriz extracelular (MEC) y contribuyendo a la inflamación crónica a través de la activación del receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE)¹². Si bien existen sistemas de desintoxicación endógenos, como la vía de la glioxalasa, para eliminar precursores dicarbonílicos reactivos como el metilglioxal, estos son incapaces de revertir los aductos AGE estables una vez formados en las proteínas³⁶.
Para superar este obstáculo biológico, empleamos un cribado computacional a gran escala seguido de evolución dirigida para diseñar la CMLase. El andamiaje inicial, una glicina oxidasa, mostró inicialmente una baja actividad inespecífica sobre la CML. Tras cinco rondas de evolución, generamos la variante CrGO-897 (CMLase), que produjo una mejora de más de 10 veces en la eficiencia catalítica sobre sustratos peptídicos y estableció una capacidad de novo para desglicolizar proteínas completas.
Si bien la eficiencia catalítica de CMLase sobre sustratos peptídicos sigue siendo aproximadamente entre 10 y 50 veces menor que la de los editores de PTM perfeccionados evolutivamente, como la desmetilasa específica de lisina 1 (LSD1)37, representa una mejora significativa con respecto al andamiaje inicial y establece una actividad enzimática de novo distintiva sobre proteínas completas.
Observamos variabilidad en la eficacia de reparación entre sustratos (por ejemplo, reducciones que oscilan entre el 52 % (BSA) y el 97 % (caseína) en diferentes sustratos proteicos), lo que sugiere una interacción compleja entre la accesibilidad del sustrato y la eficiencia de detección de anticuerpos. El análisis de la especificidad de la CMLase mediante proteómica en BSA sugiere que la señal residual de ELISA podría derivarse de unas pocas modificaciones inmunodominantes resistentes a la CMLase. Finalmente, la capacidad de la CMLase para reducir la carga de CML en más del 70 % y el 55 % en tejido arterial y cutáneo humano de edad avanzada, respectivamente, demuestra que la enzima funciona eficazmente en el entorno heterogéneo y estéricamente complejo de la matriz extracelular humana envejecida.
A pesar de estos prometedores resultados ex vivo, es necesario abordar las limitaciones relativas a la restauración funcional y la seguridad antes de su aplicación clínica. Si bien demostramos la reversión química de la CML, aún queda por determinar si esto se traduce en la recuperación de la biomecánica tisular o en la supresión de la señalización patogénica de RAGE in vivo. Además, nuestros hallazgos actuales en tejidos de piel, arterias y cristalino utilizaron proteínas homogeneizadas o secciones delgadas fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE), donde se maximiza la accesibilidad del sustrato.
En el contexto de órganos vivos e intactos, debe evaluarse la capacidad de una enzima para penetrar la densa arquitectura reticulada de la matriz extracelular (MEC). El espectro de sustratos de la CMLase aún no se ha delimitado por completo; si bien hemos demostrado que la enzima es selectiva para el aducto de lisina ε-amina sobre el aducto de arginina químicamente relacionado CMA, la actividad sobre la carboximetilación de α-amina en los extremos N-terminales de las proteínas no se probó directamente y requiere caracterización futura. Además, el origen bacteriano de la enzima exige una evaluación rigurosa de la inmunogenicidad, lo que podría requerir estrategias de desinmunización proteica o inmunomodulación si se requiere una dosificación repetida. En cuanto a los subproductos de la reacción, el peróxido de hidrógeno y el glioxilato están presentes de forma natural en los fluidos biológicos y son eliminados eficazmente por las enzimas metabólicas38,39. Dado que la CML existe en bajas concentraciones en relación con los metabolitos totales, y la CMLase presenta una actividad fuera de objetivo mínima, se espera que el eflujo de subproductos generados durante la reparación sea insignificante en relación con la capacidad de eliminación endógena. Los estudios futuros deberán abordar la farmacocinética de la penetración tisular y la posible inmunogenicidad, asegurando que la CMLase pueda alcanzar las modificaciones aisladas en el espacio intersticial para lograr una reparación sistémica o localizada significativa.
El trabajo actual en nuestro laboratorio se centra en optimizar aún más la eficiencia catalítica de la CMLase y adaptar la enzima a los requisitos de las aplicaciones traslacionales.
Este trabajo establece una prueba de concepto para la desglucosación de tejidos envejecidos. La CML es un ligando principal de RAGE, y la señalización de RAGE se ha implicado en muchas complicaciones asociadas a la edad y la diabetes8,12,40. Por lo tanto, reducir la carga de CML en proteínas envejecidas de larga vida podría representar una estrategia viable para disminuir la carga de enfermedad en personas mayores y diabéticas. Si bien la CML es solo una de las muchas modificaciones relacionadas con la edad y su reversión por sí sola no resolverá el fenotipo multifactorial del envejecimiento, la plataforma de evolución dirigida establecida aquí puede adaptarse para atacar otros AGE patógenos. Por ejemplo, el glucospano es un entrecruzamiento dominante en los tejidos humanos que puede comprometer la elasticidad del tejido y actualmente es resistente a la reversión3. La ingeniería exitosa de CMLase sugiere que otras enzimas oxidativas o hidrolíticas podrían evolucionar para atacar el panorama químicamente diverso de modificaciones de proteínas relacionadas con la edad. Al revertir una característica distintiva del envejecimiento, CMLase proporciona una herramienta poderosa para analizar la causalidad molecular y sienta las bases para el desarrollo de terapias regenerativas que reparen los tejidos dañados.

NOTA: Este es un resumen bastante amplio de un artículo publicado. El texto completo, las tablas, los gráficos, las figuras y más detalles
           se pueden encontrar en la revista mencionada al principio.

REFERENCIAS

1. Ulrich, P. & Cerami, A. Protein glycation, diabetes, and aging. Recent Prog. Hormone Res.56, (2001).
2. Monnier, V. M., Genuth, S. & Sell, D. R. The pecking order of skin Advanced Glycation Endproducts (AGEs) as long-term markers of glycemic damage and risk factors for micro- and subclinical macrovascular disease progression in Type 1 diabetes.  J.33, 569–579 (2016).
3. Sell, D. R. et al. Glucosepane is a major protein cross-link of the senescent human extracellular matrix. Relationship with diabetes.  Biol. Chem.280, 12310–12315 (2005).
4. Monnier, V. M. & Cerami, A. Nonenzymatic browning in vivo: possible process for aging of long-lived proteins. Science (New York, N.Y.)211, (1981).
5. Sell, D. R. et al. Longevity and the genetic determination of collagen glycoxidation kinetics in mammalian senescence.  Natl. Acad. Sci. USA93, 485–490 (1996).
6. Bucala, R. & Cerami, A. Advanced glycosylation: chemistry, biology, and implications for diabetes and aging.  Pharm.23, 1–34 (1992).
7. Macchiarella, G. et al. Disease association of anti‒carboxyethyl lysine autoantibodies in hidradenitis suppurativa.  Investig. Dermatol.143, 273–283 (2023).
8. Ramasamy, R. et al. Advanced glycation end products and RAGE: a common thread in aging, diabetes, neurodegeneration, aninflammation. Glycobiology15, 16R–28R (2005).
9. Baynes, J. W., Monnier, V. M., Ames, J. M. & Thorpe, S. The Maillard Reaction: Chemistry at the Interface of Nutrition, Aging, and Disease. (Wiley-Blackwell, 2005).
10. Reddy, S., Bichler, J., Wells-Knecht, K. J., Thorpe, S. R. & Baynes, J. W. N epsilon-(carboxymethyl)lysine is a dominant advanced glycation end product (AGE) antigen in tissue proteins. Biochemistry34, 10872–10878 (1995).
11. Ikeda, K. et al. N (epsilon)-(carboxymethyl)lysine protein adduct is a major immunological epitope in proteins modified with advanced glycation end products of the Maillard reaction. Biochemistry35, (1996).
12. Kislinger, T. et al. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine adducts of proteins are ligands for receptor for advanced glycation end products that activate cell signaling pathways and modulate gene expression.  Biol. Chem.274, 31740–31749 (1999).
13. Mossad, O. et al. Gut microbiota drives age-related oxidative stress and mitochondrial damage in microglia via the metabolite N-carboxymethyllysine.  Neurosci.25, 295–305 (2022).
14. Di Sanzo, S. et al. Mapping protein carboxymethylation sites provides insights into their role in proteostasis and cell proliferation.  Commun.12, 1–22 (2021).
15. Schmidt, A. M. et al. Receptor for advanced glycation end products (AGEs) has a central role in vessel wall interactions and gene activation in response to circulating AGE proteins.  Nat. Acad. Sci. USA91, (1994).
16. Gaens, K. H. J. et al. Nε-(carboxymethyl)lysine-receptor for advanced glycation end product axis is a key modulator of obesity-induced dysregulation of adipokine expression and insulin resistance. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol.34, 1199–1208 (2014).
17. Chaudhuri, J. et al. The role of advanced glycation end products in aging and metabolic diseases: bridging association and causality. Cell Metab.28, 337–352 (2018).
18. Monnier, V. M., Sell, D. R., Nagaraj, R. H. & Miyata, S. Mechanisms of protection against damage mediated by the Maillard reaction in aging. Gerontology37, 152–165 (1991).
19. Maessen, D. E. M., Stehouwer, C. D. A. & Schalkwijk, C. G. The role of methylglyoxal and the glyoxalase system in diabetes and other age-related diseases.  Sci. (Lond.)128, 839–861 (2015).
20. Use of aminoguanidine (Pimagedine) to prevent the formation of advanced glycation endproducts.  Biochem. Biophys.419, 31–40 (2003).
21. Gomi, K. & Horiuchi, T. Purification and characterization of a new enzyme, N-alkylglycine oxidase from Cladosporium sp. G-10. Biochim Biophys. Acta1429, 439–445 (1999).
22. Job, V., Marcone, G. L., Pilone, M. S. & Pollegioni, L. Glycine oxidase from Bacillus subtilis. Characterization of a new flavoprotein.  Biol. Chem.277, 6985–6993 (2002).
23. Nishiya, Y. & Imanaka, T. Purification and characterization of a novel glycine oxidase from Bacillus subtilis. FEBS Lett.438, 263–266 (1998).
24. Jumper, J. et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature596, 583–589 (2021).
25. Database, A. P. S. AlphaFold Protein Structure Database. https://alphafold.ebi.ac.uk/.
26. Li, Z., Deng, Y. & Yang, G.-Y. Growth-coupled high throughput selection for directed enzyme evolution.  Adv.68, 108238 (2023).
27. Valencia, J. V. et al. Advanced glycation end product ligands for the receptor for advanced glycation end products: biochemical characterization and formation kinetics.  Biochem324, 68–78 (2004).
28. Glenn, J. V. et al. Confocal Raman microscopy can quantify advanced glycation end product (AGE) modifications in Bruch’s membrane leading to accurate, nondestructive prediction of ocular aging. FASEB J.21, 3542–3552 (2007).
29. Schleicher, E. D., Wagner, E. & Nerlich, A. G. Increased accumulation of the glycoxidation product N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in human tissues in diabetes and aging.  Clin. Invest99, 457–468 (1997).
30. Verzijl, N. et al. Age-related accumulation of Maillard reaction products in human articular cartilage collagen. Biochemical J.350, 381 (2000).
31. Mapping glycation and glycoxidation sites in collagen I of human cortical bone. BBA Advances3, 100079 (2023).
32. Ellmer, D., Brehs, M., Haj-Yahya, M., Lashuel, H. A. & Becker, C. F. W. Single Posttranslational Modifications in the Central Repeat Domains of Tau4 Impact its Aggregation and Tubulin Binding. Angewandte Chemie (International ed. in English)58, (2019).
33. Shapiro, R., McManus, M. J., Zalut, C. & Bunn, H. F. Sites of nonenzymatic glycosylation of human hemoglobin A.  Biol. Chem.255, 3120–3127 (1980).
34. Raghavan, C. T. et al. AGEs in human lens capsule promote the TGFβ2-mediated EMT of lens epithelial cells: implications for age-associated fibrosis. Aging Cell15, 465–476 (2016).
35. Baynes, J. W. The Maillard Reaction: Chemistry at the Interface of Nutrition, Aging, and Disease. (2005).
36. Schalkwijk, C. G. & Stehouwer, C. D. A. Methylglyoxal, a Highly Reactive Dicarbonyl Compound, in Diabetes, Its Vascular Complications, and Other Age-Related Diseases.  Rev.100, 407–461 (2020).
37. Dhall, A. et al. Nucleosome binding by the lysine specific demethylase 1 (LSD1) enzyme enables histone H3 demethylation. Biochemistry59, 2479 (2020).
38. Sies, H. Hydrogen peroxide as a central redox signaling molecule in physiological oxidative stress: Oxidative eustress. Redox Biol.11, 613–619 (2017).
39. Marangella, M., Petrarulo, M., Vitale, C., Cosseddu, D. & Linari, F. Plasma and urine glycolate assays for differentiating the hyperoxaluria syndromes.  Urol.148, 986–989 (1992).
40. Xie, J. et al. Structural basis for pattern recognition by the receptor for advanced glycation end products (RAGE).  Biol. Chem.283, 27255–27269 (2008).
41. Cozens, C. & Pinheiro, V. B. Darwin Assembly: fast, efficient, multi-site bespoke mutagenesis. Nucleic Acids Res46, e51 (2018).
42. Gaun, A. et al. Automated 16-Plex plasma proteomics with real-time search and ion mobility mass spectrometry enables large-scale profiling in naked mole-rats and mice.  Proteome Res20, 1280–1295 (2021).
43. Traylor, M. J. et al. Comprehensive discovery and quantitation of protein heterogeneity via LC-MS/MS peptide mapping for clone selection of a therapeutic protein.  Chem.88, 9309–9317 (2016).
44. Pradhan, G. et al. Multiple-parallel-protease digestion coupled with high-resolution mass spectrometry: An approach towards comprehensive peptide mapping of therapeutic mAbs.  Proteom.232, 104053 (2021).
45. Zhang, Z. Prediction of low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.  Chem.76, 3908–3922 (2004).
46. Perez-Riverol, Y. et al. The PRIDE database at 20 years: 2025 update. Nucleic Acids Res53, D543–D553 (2025).