LABORATORIO DE URGENCIAS

Vitamina B12 - Crucial Para Reprogramación Celular y Regeneración Tisular

                                                                                 Marta Kovatcheva; Elena Melendez; Dafni Chondronasiou;
                                                                                 Federico Pietrocola; Manual Serrano et al.

                                                                                                      Nature Metabolism (2023); volume 5, pages1911–1930

 Dado el profundo impacto que la alteración de la microbiota tuvo en la reprogramación in vivo, razonamos que un análisis funcional de los cambios microbianos durante este proceso podría iluminar los requisitos previamente desconocidos para la reprogramación.
Con este fin, aislamos ADN bacteriano de muestras de heces pareadas de ratones que expresaban OSKM y ratones de control de camada de tipo salvaje (WT) antes y después de 7 días de tratamiento con doxiciclina, y realizamos una secuenciación metagenómica shot gun. En los ratones WT y OSKM, la diversidad microbiana medida por el índice de Shannon disminuyó después de 7 días de tratamiento con doxiciclina, y la pérdida más profunda de diversidad ocurrió en los ratones reprogramados. A nivel de género, los ratones reprogramados se caracterizaron por una expansión relativa de Chlamydia, Bacteriodes y Alistipes spp. y una contracción relativa de Muribaculaceae. Se ha informado que Muribaculaceae se contrae durante la lesión colónica inflamatoria, que comparte características con la reprogramación in vivo, incluida la inflamación y la pérdida de identidad celular diferenciada. Por otra parte, se ha informado que Alistipes promueve la producción colónica de interleucina (IL)-6, que es un mediador importante de la reprogramación in vivo.
Nuestro enfoque de genoma completo nos permitió investigar cambios no solo en la abundancia de especies bacterianas, sino también en la composición genética y los grupos de ontología, lo que podría descubrir vías relevantes para la reprogramación. Sorprendentemente, descubrimos que los módulos genéticos microbianos relacionados con la biosíntesis y el metabolismo de la cobalamina (vitamina B12) dominaban los grupos de ontología genética (GO) bacterianos alterados durante la reprogramación. En condiciones de biodisponibilidad de cobalamina alterada, la competencia por las vitaminas puede cambiar la abundancia relativa de bacterias productoras y usuarias de cobalamina en un proceso conocido como "remodelación corrinoide". Encontramos cambios microbianos consistentes con este fenómeno en la reprogramación: los pocos géneros de bacterias capaces de sintetizar B12 (~20 géneros) generalmente se enriquecieron en ratones OSKM después de 7 días de doxiciclina, siendo Proteus, Escherichia y Salmonella los más significativamente enriquecidos entre los sintetizadores de B12.
Los cambios observados en la microbiota intestinal podrían ser indicativos de un déficit sistémico de B12, que afecta no solo a la microbiota sino también a toda la fisiología del huésped. Para probar esto, examinamos los niveles sistémicos de vitamina B12 en el suero durante la reprogramación, que se redujeron significativamente en ratones OSKM después de 7 días de administración de doxiciclina.
El hígado es uno de los órganos con mayor demanda de vitamina B12 y, como tal, es sensible a la deficiencia de B12. En roedores, esto se manifiesta como un agotamiento de fosfatidilcolinas (PC), que son producidas en grandes cantidades por el hígado de manera dependiente de B12. Observamos que las PC se redujeron significativamente en el suero de los ratones reprogramados en comparación con los ratones WT tratados con doxiciclina. Es importante destacar que el hígado de los ratones OSKM no muestra cambios histológicos después de 7 días de doxiciclina9, lo que hace que la reducción de las PC no refleje una disfunción hepática como resultado de la reprogramación.
El riñón es otro órgano refractario a la reprogramación en nuestro modelo de ratón3; sin embargo, observamos una disminución significativa de la vitamina B12 en los túbulos proximales durante la reprogramación. El riñón es el sitio principal de concentración y almacenamiento de vitamina B12 en roedores, desde donde se libera para su uso por otros órganos en caso de deficiencia sistémica. En conjunto, estos resultados sugieren que la vitamina B12 se agota sistémicamente durante la reprogramación in vivo, lo que afecta tanto a la microbiota colónica como al huésped.
Dada la reducción sistémica de la vitamina B12 durante la reprogramación in vivo, planteamos la hipótesis de que la suplementación con vitamina B12 podría mejorar la reprogramación en condiciones normales (es decir, en ausencia de ABX).
De hecho, la suplementación con vitamina B12 mejoró significativamente la reprogramación in vivo en el páncreas, el colon y el estómago, según se evaluó por el grado de displasia histológica y los niveles de SCA1 o KRT14.
La vitamina B12 también aumentó la cantidad de células NANOG+, un marcador de pluripotencia total, en el páncreas. La administración de vitamina B12 no afectó la expresión del transgen. Incluso después de la suplementación con vitamina B12, no pudimos detectar evidencia histológica de reprogramación en el riñón. Sin embargo, observamos un aumento significativo de las reservas de vitamina B12 dentro del riñón después de la suplementación, lo que indica que la absorción, distribución y almacenamiento de vitamina B12 se estaban produciendo normalmente en los ratones reprogramados.
También nos preguntamos si la suplementación con vitamina B12 podría rescatar el defecto de reprogramación de los ratones tratados con ABX. Curiosamente, la suplementación con vitamina B12 pudo rescatar parcialmente la reprogramación en el colon. Esto respalda el concepto de que un papel importante de la microbiota durante la reprogramación murina es aumentar el suministro dietético de vitamina B12 a través de la coprofagia. Otra vitamina B que es suministrada parcialmente por la microbiota en roedores y humanos es la vitamina B9 (folato), que está funcionalmente relacionada con la vitamina B12. Sin embargo, la co-suplementación de vitamina B12 y B9 fue indistinguible de la vitamina B12 sola. En conjunto, estos resultados demuestran que la vitamina B12 es un factor limitante para la reprogramación in vivo.
Se estudió la microbiota fecal murina durante la reprogramación para descubrir que la vitamina B12 es un factor limitante para la reprogramación celular tanto in vitro como in vivo. Demostramos que las células que se someten a reprogramación experimentan una demanda elevada de vitamina B12, asociada con mayores niveles de la enzima MS dependiente de B12 y una mayor expresión de Cd320, que codifica el receptor de captación de vitamina B12 celular. La MS funciona para generar Met, que se convierte en SAM, el donante esencial de 1C para todas las reacciones de metilación.
Informamos que SAM es fundamental para la mejora de la eficiencia de reprogramación impartida por la vitamina B12. El metabolismo de un carbono y SAM, a través de su donación de grupos metilo, son necesarios para la reconfiguración epigenética asociada con la reprogramación celular. Desde el punto de vista mecanístico, hemos descubierto que la insuficiencia de vitamina B12 durante la reprogramación de OSKM ha provocado cambios en los niveles de muchas marcas de metilación de histonas, incluida la incapacidad de trimetilar correctamente H3K36 en los cuerpos de los genes transcritos, lo que ha provocado un aumento de los niveles de CT. La CT tiene efectos negativos sobre la aptitud celular y del organismo y compromete la capacidad de autorrenovación de las células madre de los mamíferos. Aunque no pudimos comprobar directamente el papel de H3K36me3 mediante la supresión de Setd2 porque técnicamente no pudimos lograr una reducción sostenida de la transcripción, la suplementación con vitamina B12 aumentó la H3K36me3 y redujo la CT durante la reprogramación, lo que se asoció a una mejora de la puntuación de reprogramación transcripcional y a un aumento general de la eficiencia de la reprogramación.
Se ha estimado que la metilación completa de tan solo el 0,1% de los nucleosomas agotaría todo el suministro de SAM intracelular, convirtiendo al epigenoma en un consumidor crítico de los niveles de SAM. SETD2, la metiltransferasa H3K36me3, tiene un KM para SAM en el rango micromolar, cercano a la concentración intracelular fisiológica de SAM. Esto hace que SETD2 sea particularmente sensible a las fluctuaciones en los niveles intracelulares de SAM, y puede explicar por qué encontramos que esta marca H3 en particular era la que más aumentaba después de la suplementación con B12.
Sin embargo, sospechamos que el papel de la B12 en la plasticidad inducida se extiende más allá de la regulación de H3K36me3 y CT. Los niveles de metilación de histonas son dinámicos e interdependientes. Se ha descrito a SAM como uno de los pocos "metabolitos centinela" de la célula, y se estima que un 1% de todas las proteínas eucariotas son metiltransferasas dependientes de SAM con diversos sustratos. Será interesante explorar cómo los cambios adicionales en la metilación de la histona H3 que observamos con la suplementación con vitamina B12, así como los cambios aún no identificados en la metilación del ADN, otras proteínas o lípidos, pueden contribuir a la mejora en la eficiencia de la reprogramación lograda por la vitamina B12.
In vivo, informamos que el agotamiento de la microbiota con antibióticos de amplio espectro limita profundamente la reprogramación. Esto solo se rescató parcialmente con la suplementación con vitamina B12, lo que indica que la microbiota desempeña funciones adicionales en el impulso de este proceso. Sospechamos que una de esas funciones es mejorar la inflamación, en particular la producción de IL-6, que es fundamental para la reprogramación in vivo.
Curiosamente, también descubrimos que la microbiota es importante para la biodisponibilidad oral de la doxiciclina más allá del tracto gastrointestinal, lo que destaca la compleja relación entre las bacterias comensales, los sistemas inducibles por doxiciclina y la reprogramación in vivo. Aprovechamos los sistemas de reprogramación in vitro, incluida la reprogramación viral sin doxiciclina, para demostrar directamente el papel limitante e intrínseco de la B12 en este proceso. Sin embargo, será interesante estudiar más a fondo las relaciones entre la B12, el metabolismo, la microbiota y la doxiciclina in vivo.
Desde una perspectiva biomédica, hemos traducido nuestros resultados a un modelo patológico de colitis ulcerosa aguda, en el que la reparación del epitelio intestinal requiere la desdiferenciación de los enterocitos a un estado similar al embrionario. Hemos demostrado que aumentar aún más esta desdiferenciación se asocia con una mejor reparación del tejido colónico, y que la vitamina B12 por sí sola puede facilitar este proceso.
En estudios futuros, sería valioso realizar un análisis de la evolución temporal más denso en presencia de vitamina B12 para refinar los detalles moleculares del proceso de reparación mejorado. Estudios anteriores han informado de un papel protector de la deficiencia crónica de B12 (es decir, antes de la administración de DSS); esto se debió a una respuesta inflamatoria atenuada a la agresión del DSS. De hecho, la deficiencia de B12 puede tener propiedades inmunomoduladoras y será interesante estudiar el impacto de la suplementación aguda de B12 posterior a una lesión sobre el compartimento inmunológico.