LABORATORIO DE URGENCIAS

Ingeniería Genética de Treponema Pallidum

                                        Emily Romeis, Lauren Tantalo, Nicole Lieberman, Quynh Phung, Alex Greninger, Lorenzo Giacani 
                                          Department of Medicine, Division  Infectious Diseases, University of Washington, Seattle, Washington, United States of America
                                                 Department of Medicine, Division  Infectious Diseases, University of Washington, Seattle, Washington, United States of America
                                                 Department of Laboratory Medicine, University of Washington, Seattle, Washington, United States of America
                                                 Department of Medicine, Division  Infectious Diseases, University of Washington, Seattle,

                                                                           PLOS (July, 2021) / https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009612

La sífilis es una infección crónica de transmisión sexual que aún representa una carga significativa para la salud pública, ya que causa una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que la incidencia global de la sífilis oscila entre 5,6 y 11 millones de casos nuevos cada año, mientras que la prevalencia de la enfermedad está entre 18 y 36 millones de casos en todo el mundo. Aunque la mayoría de esos casos ocurren en países de ingresos bajos y medianos donde la enfermedad es endémica, las tasas de sífilis han aumentado de manera constante en los países de ingresos altos durante décadas, incluido Estados Unidos. En estos países, se ven afectados principalmente los hombres que tienen sexo con hombres (HSH) y las personas que viven con el VIH (PVVIH). En Estados Unidos, la tasa de sífilis temprana en 2019 (11,9 casos por cada 100.000 habitantes) representó un aumento del 460% en comparación con los casos notificados en 2000 (2,1 casos por cada 100.000 habitantes). Si no se trata, la sífilis puede progresar y afectar los sistemas cardiovascular y nervioso central del paciente, lo que puede provocar manifestaciones graves como aneurisma aórtico, accidente cerebrovascular, pérdida auditiva o visual, demencia y parálisis. Además, la transmisión maternoinfantil de la sífilis durante el embarazo es responsable de hasta el 50% de los mortinatos en África subsahariana y de una alta proporción de casos de morbilidad y mortalidad perinatal.
Una mejor comprensión de la biología de T. pallidum y la patogénesis de la sífilis ayudaría a diseñar medidas más eficaces para el control de la enfermedad. Recientemente, Edmondson et al. describieron un método para la propagación continua de T. pallidum in vitro mediante un sistema basado en cultivo celular, desarrollado previamente por Fieldsteel et al. Este método representó un avance importante en el campo, ya que proporcionó a los investigadores una alternativa a la propagación de cepas treponémicas en conejos de laboratorio.
A pesar de este avance, una limitación en el estudio de T. pallidum siguió siendo la falta de herramientas para la modificación genética de este patógeno. Sin embargo, la disponibilidad del sistema de cultivo facilitó la experimentación con procedimientos de transformación y selección para introducir ADN foráneo en el genoma de T. pallidum.
En este trabajo, describimos un protocolo que nos permitió integrar con éxito un casete de resistencia a la kanamicina (kanR) en un pseudogén (tprA, codificado por el gen tp0009) de la cepa SS14 de T. pallidum, utilizando un vector suicida que transporta el gen de resistencia entre dos brazos de homología idénticos a las regiones aguas arriba y aguas abajo del pseudogén. La confianza en nuestro logro se sustenta en los resultados de técnicas complementarias, como la PCR cualitativa y la RT-PCR, la PCR digital cuantitativa de gotas (ddPCR) y la RT-ddPCR, la secuenciación genómica completa (WGS), el ensayo de susceptibilidad a la kanamicina, la espectrometría de masas (MS) y la propagación in vivo de treponemas transformados. Aunque eliminamos un pseudogén, lo cual no nos permitió obtener un mutante sin fenotipo conocido para evaluarlo mediante ensayos funcionales, esto demuestra que la transformación y la manipulación genética de T. pallidum son factibles.
Este es un avance significativo en este campo. Nuestro descubrimiento abre numerosas posibilidades, incluyendo estudios genéticos clásicos en este patógeno, la tan esperada aplicación de técnicas de genómica funcional e incluso la posibilidad de dirigirse a los factores de virulencia responsables de la evasión y persistencia inmunitaria para obtener una cepa atenuada que sirva de base para el desarrollo de vacunas.

Resultados
El plásmido de transformación fue un vector suicida basado en pUC57, donde el gen kanR se colocó entre dos brazos de homología de ~1 kpb, idénticos a las regiones aguas arriba (998 pb) y aguas abajo (999 pb) del marco de lectura abierto (ORF) de tprA, respectivamente.
Para impulsar la expresión del gen kanR, se seleccionó el promotor del gen tp0574 (que codifica la lipoproteína de 47 kDa), previamente identificado por Weigel et al., basándose en la evidencia experimental de que tp0574 se encuentra entre los genes con mayor transcripción en T. pallidum y posiblemente se expresa de forma constitutiva en este patógeno.
La secuencia del gen kanR se derivó del plásmido Rts1, un plásmido conjugativo de gran tamaño aislado originalmente de Proteus vulgaris. No se realizó la optimización de codones porque el contenido de GC del gen kanR (44%) se consideró suficientemente cercano al contenido de GC del genoma de T. pallidum (~51%). El constructo plasmídico ptprAarms-tp0574prom-kanR, basado en pUC57, se utilizó para transformar treponemas SS14 silvestres (wt-SS14). Las células de T. pallidum transformadas se propagaron posteriormente en medios suplementados con kanamicina (25 μg/ml, eficaz en experimentos de selección de otras espiroquetas). Dado que el tampón de transformación contenía CaCl₂ para aumentar la permeabilidad de la membrana y facilitar la absorción del plásmido, también expusimos las células wt-SS14 solo al tampón de transformación (sin plásmido, para descartar la letalidad del CaCl₂ para los treponemas) y procedimos a propagarlas en medios de cultivo sin antibiótico. Además, para garantizar que los treponemas no transformados no sobrevivieran a la exposición a la kanamicina a la concentración utilizada para la selección in vitro, la cepa wt-SS14 también se propagó en medios que contenían 25 μg/ml de kanamicina. Debido al largo tiempo de generación de la cepa SS14 (~44 horas), las células de T. pallidum se subcultivaron cada 14 días en lugar de cada semana hasta el pase n.º 7 y semanalmente a partir de entonces. Los treponemas knockout de tprA transformados (tprAko-SS14) pudieron contarse microscópicamente 2 semanas después de la transformación, aunque solo se pudieron ver 2,4 treponemas por campo de microscopio de campo oscuro (DFM) en este momento (que corresponde a una concentración de 2,4 x 106 células de T. pallidum/ml). Para los treponemas transformados, la densidad celular aumentó cuatro semanas después de la transformación y se mantuvo estable durante el pase n.º 6 (semana 10 después de la transformación). Durante esta ventana (pases n.º 2-6), el número promedio de treponemas contados fue de 2,8 x 107 células/ml. La densidad de células wt-SS14 tratadas solo con CaCl₂ fue mayor que la de las células tprAko-SS14 ya en el Pase n.° 2, lo que sugiere que el CaCl₂ no dañó los treponemas. La propagación de esta cepa se detuvo en el Pase n.° 6 (semana 10 después de la exposición).
Las células SS14 de tipo silvestre propagadas en medios con kanamicina no se observaron en el DFM durante 10 semanas de propagación, lo que confirma la capacidad de 25 μg/ml de kanamicina para inhibir el crecimiento de T. pallidum in vitro. Durante los Pases n.° 7-10, se incrementó el inóculo treponémico de tprAko-SS14 para obtener suficientes células para experimentos posteriores. Durante estos pases, el número promedio de células treponémicas contadas fue de 2,8 x 10⁻¹ células/ml. En general, estos datos respaldan la obtención de una cepa resistente a la kanamicina mediante la transformación de la cepa wt-SS14 con el vector ptprAarms-tp0574prom-kanR.En el pase n° 8 (semana 13 después de la transformación), se recolectaron células tprAko-SS14 y se procesaron para:
a) PCR para confirmar la integración del gen kanR en el locus tprA,
b) RT-PCR para evaluar la presencia del mensaje del gen kanR, y
c) ddPCR cuantitativa para evaluar la relación entre el gen kanR y otras tres dianas: tprA (tp0009), dnaA (tp0001) y tp0574.
Se utilizaron como control muestras de la cepa wt-SS14 propagadas en paralelo a la cepa tprAko-SS14. Inicialmente, se empleó una PCR cualitativa de largo alcance para confirmar la integración de la secuencia tp0574prom-kanR en el locus tprA. Para ello, se emplearon cebadores que se anillaban a la región genómica de T. pallidum que flanquea los brazos de homología de tprA del constructo y al gen kanR, respectivamente. En estas reacciones, se amplificaron muestras de ADN extraídas de células tprAko-SS14 y de la cepa wt-SS14 con los pares de cebadores 1+2, 3+4, 1+3, 5+6 y 2+4. La amplificación del gen tp0574 se realizó como control positivo. Como era de esperar, la amplificación con los pares de cebadores 1+2 y 3+4 solo arrojó un resultado positivo al usar el ADN de tprAko-SS14 como molde, lo que demuestra la integración del gen kanR. La amplificación del gen kanR solo fue positiva con el ADN extraído de tprAko-SS14 y el ADN del plásmido de transformación, usado como control positivo (subpanel c), mientras que la amplificación negativa con el par de cebadores 5+6 (anexión a la estructura principal del vector; subpanel d) no mostró plásmido residual en el cultivo de tprAko-SS14 y que el amplicón kanR (en el subpanel c) no se debía al vector residual usado para la transformación semanas antes. Al combinarse, los cebadores 2+4 generaron un amplicón de 3746 pb con el ADN molde de la cepa tprAko-SS14 (subpanel e), que tenía el tamaño esperado si el pequeño gen kanR (816 pb) reemplazaba al pseudogén tprA (1821 pb), y un amplicón de 4643 pb en la cepa silvestre y un residuo indetectable de wt-SS14 en los pocillos de cultivo de tprAko-SS14. Como era de esperar, la amplificación del gen tp0574 fue uniformemente positiva tanto para la cepa transformada como para la silvestre (subpanel f). En general, estos datos mostraron que el gen kanR se integró en el genoma de la cepa tprAko-SS14 en lugar del pseudogén tprA, y no se pudo amplificar ningún plásmido residual del cultivo. El ARN extraído de las cepas tprAko-SS14 y wt-SS14 (Pasaje n.º 8, semana 13 después de la transformación) se trató con DNasa I para eliminar el ADN residual y se transcribió de forma inversa. El ADNc se utilizó como molde para evaluar la transcripción del gen kanR y los genes tp0574, así como del gen tprA. Estudios previos en otras cepas de T. pallidum con un pseudogén tprA sugirieron que este locus se transcribe a un nivel muy bajo en estas cepas, a pesar de que la secuencia codificante contiene un desplazamiento del marco de lectura que truncaría el péptido resultante durante la traducción. Los resultados mostraron que el gen kanR se expresa solo en tprAko-SS14 (subpanel g). Como se esperaba, tp0574 se expresó en ambas cepas (subpanel h). No se detectó ARNm específico de tprA en ninguna de las muestras de los cultivos tprAko y wt recolectados en este momento; sin embargo, en las muestras recolectadas en pases posteriores, se detectó el mensaje específico de tprA en wt-SS14 propagado junto con la cepa tprAko-SS14, pero nunca en la cepa tprAko-SS14. Estos resultados respaldaron que el transgén kanR se transcribe activamente desde el promotor tp0574 en la cepa tprAko-SS14, mientras que el pseudogén tprA ya no se transcribe en esta cepa debido a la ablación de tprA.
A continuación, realizamos PCR digital de gotas (ddPCR) en los loci kanR, dnaA y tprA en un laboratorio independiente para evaluar la proporción de copias entre estos genes. En la cepa tprAko-SS14, la relación kanR:dnaA fue de 1,05, mientras que la relación tprA:dnaA fue prácticamente nula. Estos datos confirmaron que:
a) la integración del gen kanR se produjo en el locus tprA;
b) esta sustitución fue estable;
c) no existían copias adicionales del gen kanR fuera del genoma de T. pallidum.

Discusión
Dado el importante impacto de la sífilis en la salud humana, existe un gran interés en profundizar la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a su patogénesis. Esto, a su vez, podría conducir a mejores estrategias para el control de la enfermedad y el desarrollo de vacunas. Un paso crucial en esta dirección es la identificación de los factores treponémicos que contribuyen a la virulencia. Hasta la fecha, diversos enfoques experimentales han ayudado a los investigadores de la sífilis a identificar y caracterizar funcionalmente estos factores, como la expresión en huéspedes heterólogos (p. ej., Borrelia burgdorferi, Treponema denticola y Treponema phagedenis), la genómica comparativa y, en cierta medida, los estudios de expresión génica y el análisis proteómico. Sin embargo, no se han utilizado estrategias de manipulación genética, en particular aquellas que cumplen con los postulados moleculares de Koch, para T. pallidum. La falta de herramientas genéticas no fue excesivamente frustrante, ya que, hasta 2018, T. pallidum ni siquiera podía propagarse continuamente in vitro. Es comprensible que esta limitación obstaculizara cualquier intento de ingeniería genética de este patógeno, ya que la selección con antibióticos no era fácil. Por el contrario, algunas especies de Chlamydia se han propagado in vitro desde la década de 1950, y sin embargo, las herramientas genéticas para este patógeno solo han estado disponibles recientemente. El protocolo que ideamos para que nuestro vector cruzara la envoltura de T. pallidum se inspiró en un protocolo anterior utilizado para introducir ADN en Chlamydia. Se prefirió el uso de CaCl₂ a métodos físicos como la electroporación simplemente porque el número de células treponémicas obtenidas mediante cultivo in vitro es aún muy limitado en comparación con otras bacterias, incluidas otras espiroquetas, que tienen un tiempo de generación significativamente menor que T. pallidum y que pueden propagarse in vitro en cultivos axénicos.
En la cepa SS14, el gen tprA no es funcional debido a una mutación por desplazamiento del marco de lectura causada por la deleción de un dinucleótido CT en la posición 712 del marco de lectura abierto (ORF) del gen anotado. La elección de derivar una cepa knockout de tprA (tprAko-SS14) fue impulsada por la alta probabilidad de que a) esta región no afectaría la viabilidad de T. pallidum si se eliminaba, siendo ya no funcional en la cepa SS14 de tipo silvestre (wt-SS14), y que b) la eliminación de este pseudogén no resultaría en un efecto polar que inhibiera la transcripción de genes aguas abajo. El locus tprA, incluso cuando codifica un gen funcional, es probable que se transcriba como un ARNm monocistrónico basado en software de predicción como Operon-mapper. Viendo en genes funcionales, la inactivación de muchos genes podría ser problemática en la espiroqueta de la sífilis, porque el pequeño tamaño de los genomas treponémicos sugiere que los genes que escaparon a la reducción genómica evolutiva podrían ser esenciales. En este escenario, los sistemas inducibles para el silenciamiento o la ablación génica serían útiles. Hoy en día, las tecnologías de recombinación dirigida al sitio se utilizan cada vez más para manipular el ADN de un organismo bajo condiciones controladas in vivo. Un ejemplo es el sistema análogo a la recombinación Cre-Lox, pero que implica la recombinación de secuencias entre los sitios diana de reconocimiento de la flipasa (FRT) corta por la recombinasa flipasa (Flp). Además, un sistema de expresión inducible sería beneficioso para los enfoques de silenciamiento génico epigenético, como el sistema CRISPR/Cas9 y TALENS.
En el futuro, también se incluye el desarrollo de plásmidos lanzadera que no necesiten integrarse en el genoma de T. pallidum, pero que sean adecuados para expresar los ORFs de T. pallidum con fines de complementación, por ejemplo, así como para expresar proteínas reporteras fluorescentes como GFP, CFP y mCherry, o enzimas reporteras como la β-galactosidasa, con el objetivo general de comprender mejor la regulación génica. La mayoría de estos objetivos ya se han alcanzado para otras espiroquetas y podrían adaptarse potencialmente a T. pallidum. La expresión de enzimas luciferasas para la obtención de imágenes in vivo, como se hace para otras espiroquetas, también podría ser deseable. La transformación de cepas de T. pallidum con plásmidos lanzadera no debería verse complicada por la presencia de plásmidos nativos, como ocurre en algunas especies de Chlamydia. Los plásmidos con el mismo origen de replicación generalmente son incompatibles y tienden a no coexistir en una célula. Por lo tanto, el mantenimiento de un plásmido nativo limita la introducción de plásmidos exógenos. La ausencia de plásmidos endógenos en T. pallidum debería eliminar el problema de la competencia por los factores de replicación plasmídica que podría dificultar la eficiencia de la transformación de los plásmidos recombinantes exógenos.
El resultado de que la proporción entre el gen kanR y tp0574 fuera mayor de lo esperado inicialmente resultó intrigante y merece ser discutido, quizás en el contexto de ensayos de detección molecular para T. pallidum. Tras la secuenciación del genoma de la cepa Nichols, se localizó oriC de T. pallidum en el nucleótido +1, basándose en la sintenia génica. La replicación del cromosoma bacteriano se inicia en una sola región oriC y se produce en ambas direcciones. Durante el crecimiento, la replicación generalmente se inicia una vez por ciclo celular; sin embargo, en condiciones óptimas de nutrientes y medio, puede iniciarse otra ronda de replicación incluso antes de que la anterior se haya completado, lo que resulta en la herencia de cromosomas parcialmente replicados por las células hijas. La replicación parcial de un cromosoma puede crear un desequilibrio en la proporción entre genes cercanos a oriC (como kanR, en nuestro caso) que ya están duplicados, y genes más alejados de oriC que aún conservan una sola copia (como tp0574, ubicado en el polo opuesto del gen kanR en el cromosoma de T. pallidum de aproximadamente 1 Mb y, por lo tanto, uno de los últimos genes en replicarse). Por lo tanto, durante el crecimiento celular activo, la proporción entre copias de genes cercanos a oriC y las más distantes puede ser notablemente superior a 1. Como se mencionó, la proporción >1 kanR:tp0574 en tprAko-SS14 cultivado probablemente refleja la replicación parcial de algunos cromosomas durante la propagación. Esto podría indicar que los genes ubicados cerca del origen de replicación podrían ser mejores dianas para la detección de T. pallidum en muestras clínicas, pero quizás los genes ubicados más lejos del origen podrían ser más adecuados para estimar el número real de células treponémicas en una muestra. El trabajo en curso en el laboratorio también se centra en el análisis del perfil transcripcional y proteómico de la cepa tprAko-SS14 en comparación con la silvestre. Resulta curioso que, según los resultados de nuestro cultivo in vitro, la cepa tprAko-SS14 creció significativamente más rápido que la silvestre. Esta diferencia no se debió a errores en los inóculos iniciales. La capacidad de la cepa transformada para proliferar más rápido también se sugirió por el hecho de que el conejo infectado con la cepa tprAko-SS14 desarrolló orquitis antes que el control no tratado, a pesar de que el inóculo era el mismo. Sin embargo, los experimentos in vivo no son concluyentes al respecto, ya que solo se utilizó un conejo como control no tratado, y el desarrollo posterior de orquitis podría deberse simplemente a la variabilidad entre conejos. No obstante, es posible que la ablación del pseudogén tprA haya conferido una ventaja selectiva y haya reducido la carga metabólica derivada de la expresión de un gen no funcional. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio con cepas de T. pallidum portadoras de un gen tprA con marco de lectura desplazado (aunque no con la cepa SS14) demostraron que tprA se transcribe en estas cepas, aunque a un nivel muy bajo.
Otros experimentos que se realizarán incluyen la repetición del experimento de transformación descrito aquí, así como la identificación de otros genes de T. pallidum que, a diferencia de tprA, nos permitirán estudiar un fenotipo. Dado que las proteínas que median la motilidad, la variación antigénica y las adherencias son los principales factores de virulencia de las espiroquetas, nos centraremos a continuación en la ablación de la expresión de los endoflagelos y en evaluar si un T. pallidum inmóvil puede establecer una infección con éxito en el huésped conejo, en la eliminación de los sitios donantes de tprK para afectar la variación antigénica y la evasión inmunitaria, y en la eliminación de adhesinas.

Conclusiones
Demostramos que la ingeniería genética de la espiroqueta de la sífilis es posible con un método relativamente simple que tiene el potencial de transformar nuestra manera de abordar el estudio de la biología de T. pallidum y la patogénesis de la sífilis.