LABORATORIO DE URGENCIAS

Disminuye Eficacia de Agentes Antimicrobianos en Entorno Polimicrobiano

                                                                                           Thomas J.O’Brien, Wendy Figueroa, Martin Welch 

                                                                                                     The ISME Journal (July, 2022), Vol.16, Issue 7: 1694–1704, 
                                                                                                                  https://doi.org/10.1038/s41396-022-01218-7

Un enfoque común para el manejo de infecciones es la intervención antimicrobiana. En este caso, se evalúa la susceptibilidad del microorganismo infectante al tratamiento antimicrobiano determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los aislados clínicos durante el crecimiento planctónico in vitro, siguiendo directrices del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). Con esta información, se seleccionan los antibióticos con mayor probabilidad de ser efectivos contra el aislado en particular. El problema surge cuando la infección no se elimina con tratamientos efectivos in vitro.
En las últimas décadas, se ha reportado un número creciente de infecciones aparentemente imposibles de tratar con la terapia antimicrobiana tradicional. Aunque muchos de estos casos están relacionados con cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos (MDR), algunos se asocian con microorganismos que muestran susceptibilidad a los antibióticos in vitro y, sin embargo, no se eliminan al ser tratados in vivo.
La resistencia microbiana a los antibióticos es relativamente común en aislados obtenidos de personas con fibrosis quística (FQ), una enfermedad causada por una actividad o una diana defectuosas del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). El/los defecto(s) resultante(s) en la función del CFTR conduce(n) a la sobreproducción de secreciones mucilaginosas ricas en nutrientes en las vías respiratorias, lo que predispone a las personas con FQ a infecciones de por vida.
Estas infecciones suelen ser polimicrobianas e incluyen bacterias como Pseudomonas aeruginosa (PA) y Staphylococcus aureus (SA), así como especies fúngicas. Sin embargo, y a pesar de los tratamientos antimicrobianos agresivos utilizados para controlar las infecciones crónicas de las vías respiratorias por FQ, los microorganismos colonizadores suelen sobrevivir.
Existe una creciente evidencia de que las interacciones entre patógenos bacterianos y otros microbios que cohabitan en el foco de infección pueden modular el perfil de expresión génica y la virulencia del patógeno. De hecho, recientemente demostramos que especies que representan tan solo el 0,05% (en número de células) pueden alterar significativamente la producción de moléculas extracelulares por una especie más abundante en la mezcla. Por lo tanto, parece muy probable que las interacciones entre especies también puedan alterar la respuesta de patógenos, como PA, a los agentes antimicrobianos. No obstante, las pruebas tradicionales de susceptibilidad a los antimicrobianos no consideran la presencia de especies cohabitantes ni cómo estos microorganismos podrían afectar la adquisición de resistencia a los antibióticos.
Si bien se sabe que algunas especies microbianas cohabitan en las vías respiratorias humanas, no existe garantía de que estas especies puedan cocultivarse de forma estable en modelos ex situ. Para solucionar este problema, recientemente introdujimos un modelo de flujo continuo que permite mantener PA, SA y Candida albicans (CA) en un medio de esputo artificial en un estado estacionario notablemente estable. En el presente estudio, examinamos los efectos de tres antimicrobianos clínicamente relevantes y específicos de cada especie (colistina, ácido fusídico y fluconazol) en poblaciones polimicrobianas en estado estacionario que contienen PA, SA y CA.
Observamos que los tres antimicrobianos específicos de cada especie muestran una menor actividad contra su microorganismo diana en los cultivos polimicrobianos, en comparación con los cultivos de una sola especie.
También identificamos un nuevo mecanismo de resistencia a la colistina en PA que surge con mayor frecuencia en presencia de otras especies. En conjunto, nuestros hallazgos resaltan la necesidad de considerar las interacciones entre especies al implementar agentes antimicrobianos en escenarios de infección polimicrobiana, y refuerzan la idea de que las especies raras o de baja abundancia pueden tener un profundo efecto en la fisiología y el comportamiento de los demás cohabitantes del nicho.

Exposición de comunidades en estado estacionario a compuestos antimicrobianos
Se cultivaron cultivos monoespecie o triple especie de P. aeruginosa PAO1, S. aureus 25923 y C. albicans SC5314 hasta que alcanzaron un estado estacionario (24 h después de la inoculación) en condiciones de flujo continuo.
Estos cultivos se trataron con el compuesto antimicrobiano apropiado a una concentración final de 2× o 5× CMI. El agente antimicrobiano se introdujo mediante una aguja estéril insertada a través del septo de goma en el puerto de HPLC. Los cultivos se incubaron durante 1 h sin flujo (Q = 0 µL min−1). Se aplicó al recipiente de cultivo una velocidad de flujo apropiada, Q = 170 µL min−1 para cultivos monoespecie de PA y SA y Q = 145 µL min−1 para cultivos monoespecie y triple especie de CA. A menos que se indique lo contrario, la configuración se incubó durante 48 h más. Las concentraciones madre de colistina (10 mg mL−1 en agua, Sigma), fluconazol (10 mg mL−1 en etanol, Sigma) y ácido fusídico (10 mg mL−1 en etanol, Sigma) se prepararon en fresco antes de cada experimento.
Los cultivos de control se trataron con un volumen igual de agua o etanol (utilizado para disolver los antimicrobianos), pero no mostraron cambios en los títulos celulares de ninguna especie tras la adición del disolvente.

RESULTADOS

Estado fisiológico de la PA en el sistema de flujo continuo
La mayoría de los agentes antimicrobianos funcionan mejor en células en crecimiento activo. Existe evidencia que sugiere que, en las vías respiratorias con fibrosis quística, la población de P. aeruginosa (PA) se mantiene en un estado de crecimiento activo. Por lo tanto, nos preguntamos si la PA en nuestro sistema de flujo continuo presentaba un crecimiento activo similar o si se mantenía en una condición más cercana a la fase estacionaria. Se utilizó PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-PCR) para monitorizar la expresión relativa de genes asociados con la fisiología de las fases exponencial y estacionaria en la PA. El nivel de expresión de cada gen se midió en muestras de PA cultivadas axénicamente, tomadas del sistema de flujo continuo y de un cultivo en lotes paralelos. A las 24 h, el cultivo de flujo continuo había alcanzado una DO600 constante (indicativa de crecimiento en estado estacionario). De igual forma, el cultivo en lotes también presentó una DO600 constante. Sin embargo, a las 24 h, la expresión de todos los genes asociados con el crecimiento en fase exponencial (rplM, rpoA, rpsM y sodB) fue alta en los cultivos de flujo continuo, mientras que la expresión de los genes asociados con la fase estacionaria (rmsA, rpoS, rmf y sodM) fue alta en los cultivos discontinuos. La expresión relativa del factor de modulación ribosomal (codificado por rmf), que convierte la subunidad 70S en un dímero 100S inactivo durante la fase estacionaria, mostró una disminución más gradual con el tiempo; sin embargo, presenta un valor de expresión relativa negativo a las 72 h. En conjunto, estos resultados sugieren que, a capacidad de carga, la población microbiana en el recipiente de cultivo de flujo continuo se mantiene estable durante la fase exponencial de crecimiento. Concentraciones inhibitorias mínimas de antimicrobianos en medio de esputo artificial
En consonancia con nuestro estudio previo, los cultivos axénicos de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (PA), Staphylococcus aureus ATCC 25923 (SA) o Candida albicans SC5314 (CA), y los cocultivos polimicrobianos de las tres especies alcanzaron un estado estacionario en cuanto al recuento de células viables a las 24 h de incubación, y no se observó ninguna diferencia significativa (p > 0,9) en el recuento de UFC mL−1 de ninguna especie después de este punto.
Luego  determinamos la concentración inhibitoria mínima (CIM) de tres compuestos antimicrobianos específicos de cada especie frente a medio de esputo artificial (ASM) cultivado con PA, SA y CA. Estos datos confirmaron que la colistina (MICPA = 4 μg mL−1) presenta poca actividad contra SA o CA, el fluconazol (MICCA = 1 μg mL−1) presenta poca actividad contra PA o SA, y el ácido fusídico (MICSA = 15,6 ng mL−1) presenta poca actividad contra PA o CA.
Para examinar la respuesta de cultivos monoespecíficos y polimicrobianos a los agentes antimicrobianos, se expusieron a cada uno de ellos con 2 o 5 veces la CMI de cada agente antimicrobiano. Tras la adición del agente antimicrobiano, se mantuvo la agitación, pero se interrumpió el flujo durante 1 h para permitir que el compuesto actuara antes de la dilución con medio fresco. Después de 1 h, el flujo de medio fresco se restableció a la velocidad original. A medida que el ASM fresco entra en el recipiente de cultivo, diluye gradualmente el agente antimicrobiano (tasa de dilución, D = 8,7 × 10⁻² y 0,102 h⁻¹ para Q = 145 y 170 µL min⁻¹, respectivamente), imitando vagamente el metabolismo y la excreción de antimicrobianos cuando se administran a un paciente in situ.

Tratamiento con colistina
Poblaciones preestablecidas de P. aeruginosa (PA), monoespecie y triple especie, se expusieron a colistina con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 2× (8 µg mL⁻¹) o de 5× (20 µg mL⁻¹). Tras la adición de colistina con una CMI de 2× al cultivo monoespecie, los títulos de PA disminuyeron 104 veces durante las primeras 3 h. Tras esto, los títulos aumentaron y, entre 24 y 48 horas después del tratamiento con colistina, alcanzaron valores significativamente superiores a los inmediatamente anteriores a la exposición al antimicrobiano. Se observó una disminución similar en los títulos de PA en el cultivo monoespecie tratado con colistina 5× CMI, aunque en este caso, entre 3 y 5 horas después del tratamiento, no se pudieron recuperar células viables de PA detectables de los recipientes de cultivo. Sin embargo, la población se recuperó rápidamente durante las siguientes 16 horas y, a las 48 horas, los títulos de PA volvieron a ser superiores (p < 0,0001) a los recuentos de células viables en estado estacionario previos a la adición de colistina.

Tratamiento con ácido fusídico
Cultivos monoespecie y triple especie que contenían S. aureus (SA) se expusieron a ácido fusídico con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 2× (31,2 ng mL−1) y una CMI de 5× (78 ng mL−1). Curiosamente, no se observaron cambios en los títulos de SA en el cultivo monoespecie tras el tratamiento con ácido fusídico con una CMI de 2×. Esto se debe presumiblemente a la dilución progresiva de este antibiótico bacteriostático en la configuración. Sin embargo, el efecto del ácido fusídico en el monocultivo fue más pronunciado al aplicarse con una CMI de 5×, con una disminución de aproximadamente 102 veces en los títulos de SA entre T = 0 h y T 8 h. Posteriormente, los títulos de SA se recuperaron y, 48 h después del tratamiento, incluso habían superado el nivel previo al tratamiento en aproximadamente 5 veces (p < 0,0001).

Tratamiento con fluconazol
Poblaciones monoespecíficas y polimicrobianas preestablecidas de C. albicans (CA) se expusieron a fluconazol con una CMI de 2× (2 µg mL−1) y una CMI de 5× (5 µg mL−1). Se observó una disminución significativa (p < 0,01) de aproximadamente 10 veces en los títulos de CA recuperados de la población axénica tratada con fluconazol con una CMI de 2× tras las primeras 8 h de tratamiento con fluconazol, aunque los títulos se recuperaron a los niveles previos al tratamiento a las 48 h. No se observaron cambios significativos en los títulos de CA en la población polimicrobiana tratada con fluconazol con una CMI de 2×.

DISCUSIÓN

En este trabajo, mostramos una clara disminución de la eficacia de tres compuestos antimicrobianos específicos de especie, de uso clínico (colistina, ácido fusídico y fluconazol) contra su microorganismo diana cuando este se cultiva como parte de un consorcio polimicrobiano en estado estacionario.
Esta observación resalta la necesidad de considerar cómo las especies cohabitantes podrían alterar la respuesta de un patógeno principal a una intervención terapéutica previamente validada. Dadas las diversas comunidades polimicrobianas asociadas con las infecciones de las vías respiratorias por fibrosis quística, nuestros hallazgos podrían explicar, en parte, las deficiencias de los regímenes actuales de tratamiento antimicrobiano para erradicar las infecciones por P. aeruginosa (PA).
Se observó que las modulaciones de la eficacia antimicrobiana en el entorno polimicrobiano involucran elementos fisiológicos (no hereditarios) y adaptativos (hereditarios). Por ejemplo, aunque el crecimiento en el cultivo polimicrobiano pareció conferir protección a S. aureus (SA) contra el ácido fusídico, no hubo diferencias en la susceptibilidad antimicrobiana de la cepa progenitora ni de ningún aislado recuperado tras la exposición al ácido fusídico. Esto indica un mecanismo fisiológico (no adaptativo) de tolerancia que requiere la presencia de PA y/o C. albicans (CA) en el co-cultivo. Por el contrario, una alta proporción de los aislados de PA o CA desafiados con colistina o fluconazol (respectivamente) mostraron resistencia hereditaria contra estos agentes. Curiosamente, el crecimiento en un ambiente polimicrobiano pareció aumentar la frecuencia de dichos aislados resistentes. El análisis WGS de aislados de PA resistentes a la acción de 1 mg mL−1 de colistina (es decir, 250× MIC) reveló SNPs/indels en siete genes involucrados en la síntesis de LPS o pilina (wzy, wbpA, wbpE, ssg, pilF, pilM y pilW). La evidencia de que las mutaciones de pérdida de función en wzy son específicamente responsables del fenotipo de resistencia a la colistina se obtuvo a través de análisis de complementación. Las modificaciones de LPS a través de la adición de 4-amino-L-arabinosa a grupos fosfato expuestos en la fracción de lípido A se han implicado previamente en conferir resistencia a la colistina [33]. Sin embargo, esta modificación de L-Ara4N está asociada con un grupo de genes específico (arnBCADTEF-pmrE; [34].
Sabemos, el presente estudio es el primero en demostrar que las mutaciones en los genes centrales de la vía biosintética de LPS también pueden dar lugar a altos niveles de resistencia a la colistina. También se encontraron SNP en genes implicados en la biosíntesis de proteínas fimbriales de tipo IV (pilinas) en la mayoría de los aislados de PA secuenciados en este estudio.
Curiosamente, las mutaciones en los genes de la biogénesis de la pilina se han identificado previamente en dos estudios separados basados ​​en WGS de aislados clínicos de PA resistentes a la colistina. Sin embargo, y más allá de esta correlación, actualmente no hay evidencia directa que vincule la síntesis de pilina con la resistencia a la colistina. Dado que el aislado G en el presente estudio pudo crecer en presencia de 1 mg mL−1 de colistina, pero solo contiene una mutación no sinónima en pilW, esto proporciona una fuerte evidencia que sugiere que la interrupción de la síntesis de pilina de tipo IV también puede dar lugar a Resistencia a la colistina. Curiosamente, las mutaciones en los genes biosintéticos de LPS y pilina son comunes entre los aislados clínicos de PA recuperados de infecciones de las vías respiratorias con fibrosis quística en etapa avanzada.
La colistina se introdujo por primera vez en la clínica en 1959, pero fue sustituida por los aminoglucósidos en la década de 1970 debido a la preocupación por su toxicidad [38]. Sin embargo, la colistina resurgió a finales de la década de 1980 y principios de la de 1990, cuando se administró para tratar las infecciones causadas por P. aeruginosa en las vías respiratorias de pacientes con fibrosis quística. Nuestro análisis del IPCD muestra que las mutaciones en los genes wbpA, wbpE y wzy se volvieron cada vez más prevalentes después de 1991, con aproximadamente el 20 % de los aislados afectados que contenían mutaciones claras de pérdida de función en wzy. [En este estudio, consideramos que las mutaciones claras de pérdida de función surgen de cambios de marco de lectura y mutaciones sin sentido]. Dado que las mutaciones sin sentido también pueden provocar pérdida de función (como se observó en los aislados A, B, C y F en el presente estudio), parece probable que la proporción real de mutaciones con pérdida de función sea superior al 20 %.]
Nuestro análisis muestra que los primeros aislados con mutaciones con pérdida de función en wzy se recolectaron aproximadamente en la época en que se reintrodujo la colistina en la práctica clínica, en 1991. Consideramos que es probable que exista un sesgo de muestreo significativo, especialmente dado que la tendencia en el número de cepas con mutaciones con pérdida de función en wzy refleja fielmente el creciente número de aislados recolectados a lo largo del tiempo.
Para llegar a una conclusión más sólida sobre si la introducción de la colistina en la práctica clínica ha tenido un impacto en la selección de mutaciones en los genes biosintéticos del antígeno O, se necesitará un conjunto de datos genómicos más amplio, que actualmente no está disponible. Nuestros resultados también proporcionan evidencia de que las intervenciones antimicrobianas específicas de cada especie pueden tener consecuencias no deseadas en la dinámica de aquellas especies que no son el objetivo del fármaco. Estas consecuencias tampoco son necesariamente predecibles: la vacancia del nicho por una especie no está necesariamente acompañada de la infiltración del nicho por otras, aunque P. aeruginosa parece ser particularmente agresiva en este sentido. Por ejemplo, en las poblaciones polimicrobianas tratadas con 5× MIC de ácido fusídico o 5× MIC de fluconazol, hubo un aumento significativo en los títulos de células PA en el punto de muestreo de 48 h (en comparación con los títulos previos al tratamiento). Esta observación respalda el modelo de clímax y ataque (CAM) de cambios dentro de una comunidad polimicrobiana después de la intervención clínica o la depuración inmunitaria propuesto por Conrad et al[39]. Brevemente, esta hipótesis sugiere que los patógenos clave de las infecciones de las vías respiratorias por FQ en etapa tardía pueden resistir la depuración de las vías respiratorias y adquirir adaptaciones que les permiten ocupar un nicho ambiental recién liberado.|
Esto suele complicar los tratamientos futuros y empeorar el pronóstico del paciente.
En resumen, demostramos que el crecimiento como comunidad polimicrobiana planctónica en estado estacionario puede aumentar la resistencia de sus habitantes a los agentes antimicrobianos, en ocasiones, en varios órdenes de magnitud. Se observó que P. aeruginosa era particularmente eficiente ocupando los nichos que otras especies dejaban vacantes como consecuencia de la acción de los antibióticos. Curiosamente, la exposición a concentraciones más bajas (pero aún letales para las cepas progenitoras) de agente antimicrobiano condujo a una mayor frecuencia de aislamientos resistentes.
El mantenimiento de dosis altas de antibióticos podría tener beneficios hasta ahora inesperados en la supresión de la RAM.
Finalmente, cabe destacar que el presente estudio no examina explícitamente el impacto del crecimiento en una biopelícula. Se sabe que la resistencia a los antimicrobianos aumenta (en comparación con el modo de crecimiento planctónico) [40] en las biopelículas. Sin embargo, recientemente hemos demostrado que la configuración de flujo continuo puede utilizarse para cultivar biopelículas polimicrobianas [19] y los esfuerzos actuales se centran en examinar cómo la exposición a antibióticos afecta la dinámica poblacional también en este modo de crecimiento.
También estamos ampliando el repertorio de especies en el sistema. colonias microbianas individuales.
Los tres antibióticos específicos de cada especie fueron menos eficaces contra su diana cuando tres patógenos estaban presentes simultáneamente.
Los antibióticos suelen analizarse para identificar la dosis mínima necesaria para detener eficazmente una infección.
El estudio muestra por qué las dosis probadas en laboratorio no siempre funcionan cuando se aplican a una persona. Sin embargo, el modelo de infección polimicrobiana utilizado en este estudio puede ayudar a determinar la dosis correcta.

"Las personas con infecciones crónicas suelen presentar coinfección con varios patógenos, pero el problema es que no lo tenemos en cuenta al decidir la dosis de un antibiótico en particular para su tratamiento".

                                                                                                                                    Thomas O’Brien

NOTA: Este es un resumen general de un artículo publicado. El texto completo, las referencias, las tablas, los gráficos, las figuras y otros               detalles se pueden encontrar en la revista mencionada al comienzo.