LABORATORIO DE URGENCIAS

Una Enzima Permite la Producción de Sulfuro de Hidrógeno en el Intestino.

                                                                                                                       Spencer C Peck, Karin Denger, Anna Burrichter, 
                                                                                                                       Stephania M Irwin , Emily P Balskus, David Schleheck 
                                                                                                                       Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, Cambridge,
                                                                                                                                              Department of Biology, University of Konstanz, D-78457 Konstanz, Germany;
    
                                                                                                                   Proc Natl Acad Sci U S A (2019 Feb);116(8):3171–3176.                                                                                                                                      doi: 10.1073/pnas.1815661116

El metabolismo de los compuestos que contienen azufre, tanto de origen dietético como del huésped, a sulfuro de hidrógeno (H₂S) por parte de la microbiota intestinal humana tiene importantes conexiones con la salud y la enfermedad del huésped (1, 2). El H₂S es un potente genotóxico y puede contribuir al desarrollo del cáncer colorrectal (3). Este metabolito también puede reducir los enlaces disulfuro en la capa de moco del epitelio intestinal, alterando su función de barrera y desempeñando potencialmente un papel en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (4). Dado que el H₂S puede inducir resistencia a los antibióticos, la producción de este compuesto en la microbiota intestinal puede desencadenar la proliferación de bacterias oportunistas durante el tratamiento antibiótico (5). Sin embargo, el H₂S producido por los microbios intestinales también puede actuar como molécula señalizadora en el huésped, lo que podría generar efectos beneficiosos, como la cardioprotección (2, 6).
Dilucidar la influencia del metabolismo del azufre de la microbiota intestinal y la producción de H₂S en la salud y la enfermedad del huésped representa un importante reto aún sin resolver en la investigación de la microbiota humana (1, 2, 7, 8). Persisten importantes lagunas en nuestra comprensión de las vías metabólicas y enzimas microbianas intestinales que generan H2S (es decir, sulfidogénesis). Por ejemplo, la bacteria intestinal humana y patógeno oportunista Bilophila wadsworthia (9) produce H2S al respirar (bi)sulfito (HSO3−) liberado de sustratos organosulfonados (R3C-SO3–), incluyendo la abundante molécula dietética y derivada del huésped taurina (2-aminoetanosulfonato), así como isetionato (2-hidroxietanosulfonato) (10). Aunque B. wadsworthia suele estar presente en baja abundancia en la microbiota colónica de humanos sanos (11), se ha asociado con apendicitis y abscesos óseos, cerebrales, hepáticos y de oído (12), así como con cáncer colorrectal (13). En ratones, B. wadsworthia puede causar inflamación sistémica (14) y prolifera concomitantemente con la aparición de colitis ulcerosa cuando los ácidos biliares conjugados con taurina son más abundantes en el tracto gastrointestinal (15).
El metabolismo de la taurina y el isetionato por B. wadsworthia implica una reacción de desulfonación para generar sulfito libre, que luego se reduce a H₂S mediante la acción de la sulfito reductasa disimilatoria (Dsr; desulfoviridina) para la conservación de energía mediante la respiración anaeróbica de sulfito (10, 16). Sin embargo, las enzimas involucradas en este paso crítico de ruptura del enlace C-S aún no se han identificado en B. wadsworthia. Las vías metabólicas conocidas para la taurina y el isetionato, descifradas casi exclusivamente en bacterias aerobias, son diversas, pero invariablemente involucran al sulfoacetaldehído como intermediario crítico (17). En estas bacterias, el sulfoacetaldehído es desulfonado por la sulfoacetaldehído acetiltransferasa (Xsc), dependiente de tiamina-difosfato (TDP) e insensible al oxígeno (18, 19), para producir acetilfosfato, que se utiliza para generar ATP o acetil-CoA, y sulfito, que luego es oxidado a sulfato por la sulfito deshidrogenasa en la mayoría de las bacterias aerobias. Cabe destacar que la enzima Xsc, que desulfona el sulfoacetaldehído, también es utilizada por la bacteria estrictamente anaerobia Desulfonispora thiosulfatigenes GKNTAU, que fermenta la taurina a acetato, amonio y tiosulfato (19).
Aunque se ha propuesto que una reacción análoga de ruptura del enlace C-S opera en la bacteria sulfidogénica B. wadsworthia, estrictamente anaeróbica y que respira taurina e isetionato, no se detectan homólogos válidos de Xsc en los genomas de estos organismos; es decir, todos los homólogos están anotados como subunidades catalíticas de unión a TDP de los genes de la acetolactato sintasa y están co-codificados con sus genes de subunidad pequeña (<33% de identidad de secuencia de aminoácidos).
Además, no se observa actividad enzimática de Xsc desulfonante de sulfoacetaldehído en extractos libres de células de células cultivadas con taurina (20).
En el presente estudio, primero investigamos el catabolismo de taurina e isetionato en la cepa de referencia del Proyecto Microbioma Humano (HMP) Bilophila wadsworthia 3.1.6 (21), y luego examinamos el catabolismo de isetionato en Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans DSM642 (16) y Desulfovibrio alaskensis G20 (22), una vez que nos dimos cuenta de que estas dos vías implican el mismo tipo de reacción de desulfonación sensible al oxígeno. Las especies de Desulfovibrio son bacterias reductoras de sulfato que también se encuentran en la microbiota intestinal humana (11, 23) y estos organismos también son de importancia clínica, asociados con infecciones abdominales y bacteriemia (24)
Dado que el catabolismo de la taurina y el isetionato es inducible en estas bacterias, adoptamos un enfoque de proteómica diferencial y genética inversa (25, 26) para identificar las vías catabólicas completas de los organosulfonatos.

RESULTADOS

Inicialmente, investigamos el paso de desulfonación faltante en el catabolismo de la taurina y el isetionato utilizando el aislado de referencia del HMP, B. wadsworthia 3.1.6 (21). La cepa 3.1.6 se cultivó en medios que contenían taurina o isetionato como aceptor de electrones. Los experimentos de proteómica implicaron a dos grupos de genes en el catabolismo de la taurina, uno de los cuales también estaba vinculado al catabolismo del isetionato. Estos grupos de genes se conservan en todos los genomas de Bilophila secuenciados. El primer grupo de genes codifica las enzimas conocidas taurina:piruvato aminotransferasa (Tpa) y alanina deshidrogenasa (Ald), como se identificó previamente en un aislado diferente de B. wadsworthia (27, 28). Tpa convierte la taurina en sulfoacetaldehído, y Ald regenera el grupo amino aceptor para Tpa. Ambas proteínas se detectaron con una alta abundancia relativa (es decir, con una puntuación de proteína y un rango de coincidencia más altos) en células cultivadas con taurina, pero no en células cultivadas con isetionato. Otra proteína codificada en este grupo de genes, una alcohol deshidrogenasa dependiente de hierro predicha (SarD), también se detectó en mayor abundancia relativa específicamente en células cultivadas con taurina, pero no se había caracterizado previamente. Sorprendentemente, el segundo grupo de genes codifica una enzima radical glicilo (GRE) y su enzima activadora radical cognada S-adenosilmetionina (SAM). Estas proteínas se detectaron consistentemente con una abundancia relativa mucho mayor (y con el rango de coincidencia más alto) tanto en células cultivadas con taurina como con isetionato. Otra proteína codificada directamente antes del GRE también se detectó con una mayor abundancia relativa en ambos tipos de células: una aldehído deshidrogenasa acilante de CoA (AdhE).
El descubrimiento de estos grupos de genes nos permitió formular una hipótesis bioquímica para el catabolismo de la taurina en B. wadsworthia. La desaminación inicial de la taurina generaría sulfoacetaldehído. En lugar de sufrir la ruptura del enlace C-S por una enzima de tipo Xsc, planteamos la hipótesis de que el sulfoacetaldehído podría reducirse a isetionato mediante la alcohol deshidrogenasa coinducida (sarD) codificada en el grupo de genes tpa-ald. Posteriormente, imaginamos que el GRE del segundo grupo de genes podría catalizar la conversión de isetionato a acetaldehído y sulfito. Las GRE son enzimas extremadamente sensibles al oxígeno que utilizan intermediarios radicales centrados en proteínas en la catálisis. El radical clave centrado en glicina se introduce postraduccionalmente mediante una enzima activadora asociada, miembro de la familia de enzimas SAM radicales. Las GRE catalizan transformaciones bioquímicas complejas que desempeñan funciones importantes en el metabolismo primario en condiciones estrictamente anóxicas, incluyendo diversas reacciones de ruptura de enlaces C-C, C-O y C-N (29). Aunque no se había informado de la ruptura del enlace C-S para ningún GRE, la secuencia de aminoácidos del GRE de Bilophila identificado se asemeja a las secuencias de la GRE 1,2-propanodiol deshidratasa de Roseburia inulinivorans, que rompe el enlace C-O (32% de identidad), la cual convierte el 1,2-propanodiol en agua y propionaldehído (propanal) (30), y a la GRE colina trimetilamina-liasa (CutC) de D. alaskensis G20, que rompe el enlace C-N (31% de identidad), la cual metaboliza la colina en trimetilamina y acetaldehído (31). Esta relación sugiere el potencial del GRE de B. wadsworthia para funcionar como una isetionato sulfito-liasa (IslA) que rompe el enlace C-S en una vía de desulfonación para la taurina. El acetaldehído producido podría metabolizarse posteriormente a acetil-CoA mediante las aldehído deshidrogenasas acilantes de CoA (adhE) codificadas en el clúster de genes GRE.
Para obtener más evidencia de esta hipótesis bioquímica y del papel del supuesto GRE metabolizador de isetionato, examinamos los genomas y proteomas de dos bacterias adicionales que utilizan isetionato (pero no taurina) como aceptor terminal de electrones y que, al igual que B. wadsworthia, no codifican un homólogo de Xsc: Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans DSM642 (16) y D. alaskensis G20 (22). Mediante un enfoque análogo de proteómica diferencial y genética inversa, identificamos maquinaria enzimática similar en estos organismos, producida específicamente durante el crecimiento con isetionato. Se detectó un GRE candidato y una enzima activadora de GRE en alta abundancia en células cultivadas con isetionato, pero no en células control. Las secuencias de estas enzimas se asemejaban notablemente a las correspondientes GRE y activasa de B. wadsworthia (identidades por pares superiores al 73 % y al 52 %, respectivamente).
Una proteína codificada junto a la presunta GRE/activasa metabolizadora de isetionato también se detectó en alta abundancia únicamente en células cultivadas con isetionato. Esta proteína de unión al sustrato (DctP), perteneciente a un transportador periplásmico tripartito independiente de ATP, podría estar implicada en el transporte de isetionato.
Encontramos grupos de genes muy similares en los genomas de una amplia gama de especies sulfidogénicas de Desulfovibrio, incluyendo Desulfovibrio fairfieldensis, Desulfovibrio piger, Desulfovibrio termitidis, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio ruminis, así como en los genomas de numerosas cepas de Desulfitobacterium, Desulfomicrobium y Desulfotomaculum. La presencia del supuesto elemento de respuesta a glucósidos (GRE) que rompe el enlace C-S en estos organismos implica fuertemente a esta enzima en el metabolismo del isetionato.

DISCUSIÓN

Nuestros esfuerzos por descifrar la base molecular de la conversión de taurina a sulfito en bacterias intestinales estrictamente anaeróbicas han revelado un GRE previamente no caracterizado, la isetionato sulfito-liasa (IslA), y su enzima activadora correspondiente (IslB). Esta enzima cataliza una desulfonación basada en radicales, generando acetaldehído, que puede metabolizarse posteriormente a acetil-CoA, y sulfito, que puede actuar como aceptor terminal de electrones. El mecanismo de reacción para la desulfonación del isetionato por la GRE IslA podría proceder de forma análoga a los mecanismos propuestos para la 1,2-propanodiol deshidratasa (PD) y CutC, que han sido respaldados experimentalmente (33, 34). Este mecanismo propuesto implicaría una abstracción inicial de un átomo de hidrógeno para formar un radical α-hidroxialquilo en C2 del isetionato, seguida de un cambio en el centro de espín para eliminar el grupo sulfonato en C1. Dado que este tipo de reacción de ruptura del enlace C-S no se conocía previamente como catalizada por GRE, el descubrimiento de IslA diversifica aún más el repertorio conocido de reacciones radicalarias catalizadas por esta superfamilia (29) y se suma al número limitado de enzimas desulfonativas microbianas caracterizadas (17, 35), incluyendo Xsc (EC 2.3.3.15), cisteato (3-sulfoalanina) sulfito-liasa, 3-sulfolactato sulfito-liasa (SuyAB) (EC 4.4.1.24), y la gama de monooxigenasas y dioxigenasas (EC 1.14.-) que desulfonan sulfonatos aromáticos y alifáticos en bacterias aerobias (36). Sorprendentemente, la lógica de las dos vías catabólicas que finalmente escinden la taurina en acetil-CoA y sulfito, ya sea en ausencia de oxígeno molecular en bacterias estrictamente anaeróbicas mediante la enzima GRE IslA, altamente sensible al oxígeno, o en bacterias aerobias a través de la enzima Xsc dependiente de TDP, insensible al oxígeno, es paralela al catabolismo del piruvato a acetil-CoA en E. coli. Durante la fermentación anaeróbica, E. coli puede utilizar la enzima GRE piruvato formiato-liasa (37), mientras que durante la respiración aerobia, esta enzima es reemplazada por una piruvato deshidrogenasa dependiente de TDP e insensible al oxígeno. Además, la observación de que D. thiosulfatigenes GKNTAU, una bacteria anaeróbica altamente especializada en la fermentación de taurina (19), utiliza una enzima Xsc (18), mientras que B. wadsworthia utiliza IslA para la respiración del sulfito de la taurina con electrones externos, como los provenientes del lactato o H2 (38), podría indicar una adaptación interesante para mantener el equilibrio redox bajo estas diferentes condiciones de crecimiento anaeróbico.
La búsqueda de enzimas IslA putativas adicionales en genomas microbianos secuenciados reveló más de 250 secuencias en la base de datos de proteínas no redundantes del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (con una identidad de aminoácidos superior al 35 % respecto a la secuencia de B. wadsworthia). Un total de 115 de estas secuencias se agruparon junto con las secuencias IslA de B. wadsworthia y Desulfovibrio en una red de similitud de secuencias con un umbral del 62% (32) y, por lo tanto, es probable que procesen isetionato o sustratos organosulfonados similares. Los análisis bioinformáticos revelaron distinciones entre estas secuencias y los GRE de actividad conocida. Por ejemplo, la comparación de las secuencias de IslA caracterizadas y putativas con las secuencias de otros GRE caracterizados reveló un residuo de glutamina conservado único (Q193) posicionado para interactuar con el grupo saliente de sulfito en un modelo de homología (29). Además, el análisis filogenético revela que IslA es parte de un grupo de ramificación profunda de secuencias previamente designadas como "GRE de función desconocida" que normalmente no están colocalizadas con genes que codifican proteínas estructurales de microcompartimentos bacterianos (39). Observamos que, si bien los homólogos de IslA se encuentran predominantemente en Deltaproteobacteria, estas enzimas también están codificadas en los genomas de muchos Firmicutes (Clostridia, Negativicutes), así como en varias Gammaproteobacteria y Bacteroidetes. Esta observación sugiere que el catabolismo anaeróbico de organosulfonatos podría estar más extendido en la diversidad microbiana de lo que se creía, y evaluar la capacidad de estos organismos para metabolizar isetionato, taurina u otros organosulfonatos constituye un tema importante para futuras investigaciones.
Finalmente, el descubrimiento de este proceso metabólico microbiano intestinal transforma nuestra comprensión de la utilización de organosulfonatos en la microbiota intestinal humana y abre nuevas oportunidades para investigar su contribución a las enfermedades humanas. Los microbios obtienen diversos beneficios al respirar organosulfonatos, incluyendo la capacidad de ocupar nichos metabólicos específicos. En comparación con la reducción de sulfato, no se requiere gasto de ATP para generar sulfito como aceptor de electrones. Cabe destacar que las dos cepas de Desulfovibrio regulan negativamente la APS reductasa durante la utilización de isetionato, mientras que B. wadsworthia es incapaz (o ha perdido la capacidad) de utilizar sulfato (10). Además, muchas bacterias que respiran sulfito presentan un estilo de vida hidrogenotrófico en el intestino humano (11, 23, 38), y en este sentido, la vía taurina/isetionato puede cumplir funciones tanto disimilatorias como asimilatorias cuando el acetil-CoA producido a partir de isetionato se canaliza directamente hacia la gluconeogénesis. La amplia distribución de estas vías anaeróbicas de taurina e isetionato en bacterias sulfidogénicas relevantes para la microbiota indica un papel importante de la respiración de organosulfonatos en este hábitat microbiano, potencialmente en el contexto de la competencia con bacterias reductoras de sulfato y arqueas metanogénicas por el H₂ producido por la fermentación bacteriana intestinal (23), o en el contexto de la alta disponibilidad de estos sustratos de organosulfonatos durante el consumo de dietas ricas en grasas (con alto contenido de taurocolato) (15) y/o en carne (con alto contenido de taurina) (40).
Además, dado que la taurina está presente en altas concentraciones en los tejidos de los mamíferos (2–20 mM) (41), esta vía también podría ser importante para la patogénesis de B. wadsworthia. El descubrimiento de la base molecular del metabolismo de la taurina en este organismo y otros microbios intestinales no solo permitirá futuros esfuerzos para comprender las funciones biológicas de esta actividad metabólica en el cuerpo humano, sino que también podría aportar nuevas estrategias para controlar la producción intestinal de H2S y las infecciones por B. wadsworthia.