LABORATORIO DE URGENCIAS

Microplásticos y Nanoplásticos en Ateromas y Eventos Cardiovasculares

                                                         
                                                                                                 Raffaele Marfella, MD. PhD; Francesco Prattichizzo, PhD;
                                                                                     Celestino Sardu,MD,PhD; Gianluca Fulgenzi,PhD; Laura 
                                                                                     Graciotti,PhD:Tatiana Spadoni, PhD;Nunzia D’Onofrio,PhD; 
                                                                                     Giuseppe Paolisso,MD et al.
                                                                                                     * Departments of Advanced Medical and Surgical Sciences Precision Medicine,Engineering,  
                                                                                                        and Mental Health and Public Medicine, Section of Statistic,University of Campania
                                                                                                     * Department of Forensic and Necroscopic Medicine, Azienda Sanitaria Napoli 2 Nord
                                                                                                     * Department of Cardiology, Hospital Cardarelli ,
                                                                                                     * Department of Vascular Surgery, Ospedale del Mare Azienda Sanitaria Locale Napoli 1
                                                                                                     * Environmental Technologies, spinoff of University of Campania Luigi Vanvitelli
                                                                                                     * Department of Advanced Biomedical Sciences, University Federico II, Naples,Milan
                                                                                                     * Departments of Clinical and Molecular Sciences (G. Fulgenzi, F.O.) and Excellence
                                                                                                     * Biomedic Sciences and Public Health,Polytechnic University of Marche,
                                                                                                     * Istituto Nazionale Ricovero e Cura per Anziani, Ancona,
                                                                                                     * Vascular Physiopathology Unit, IRCCS Neuromed, Pozzilli (C.V.),
                                                                                                     * Department of Medicine, Surgery, and Dentistry, University of Salerno, Salerno 
                                                                                                     * Department of Environmental, Biologic,and Pharmaceutical Sciences and Technologies,  
                                                                                                        University of Campania Luigi Vanvitelli,
                                                                                                     * Department of Clinical and Molecular Medicine, Sapienza University of Rome (E.B.)
                                                                                                        UniCAMILLUS, International Medical University (G.P.)
                                                                                                     * Cardiovascular Center Aalst, OLV Hospital, Aalst, Belgium (P.P.);
                                                                                                     * Harvard Medical School and the Division of Endocrinology, Diabetes, and Hypertension,
                                                                                                        Brigham and Women’s Hospital, Boston (A.E.C.)
                                                                                                     * University Hospitals, Case Western Reserve School of Medicine,Cleveland (S.R.).

                                                                                                   N Engl J Med (March,2024) vol:390;(10):900-910
                                                                                                               DOI: 10.1056/NEJMoa2309822

La producción de plásticos aumenta constantemente y se prevé que esta tendencia continúe hasta 2050.1. Los plásticos pueden contaminar el medio ambiente a través de las corrientes oceánicas, los vientos atmosféricos y los fenómenos terrestres, lo que contribuye a su amplia distribución.2,3. Una vez liberados en la naturaleza, los plásticos son susceptibles a la degradación, lo que da lugar a la formación de microplásticos (partículas menores de 5 mm) y nanoplásticos (partículas menores de 1000 nanómetros). Ambos tipos de partículas desencadenan diversos efectos toxicológicos.4,5. Diversos estudios han demostrado que los microplásticos y nanoplásticos (MNP) ingresan al cuerpo humano por ingestión, inhalación y contacto con la piel, donde interactúan con tejidos y órganos.5,6. Se han encontrado MNP en determinados tejidos humanos, como la placenta,7 los pulmones8/y el hígado,9 así como en la leche materna,10 la orina11 y la sangre.12 Estudios recientes realizados en modelos preclínicos han sugerido que los MNP constituyen un nuevo factor de riesgo para las enfermedades cardiovasculares. Los datos de estudios in vitro sugieren que las nanopartículas magnéticas (NPM) específicas promueven el estrés oxidativo, la inflamación y la apoptosis en células endoteliales y otras células vasculares; los modelos animales respaldan la función de las NPM en la alteración de la frecuencia cardíaca, el deterioro de la función cardíaca, la fibrosis miocárdica y la disfunción endotelial.13 Sin embargo, se desconoce la relevancia clínica de estos hallazgos. No existen pruebas que demuestren que las NPM se infiltran en las lesiones vasculares en humanos ni que respalden una asociación entre la carga de NPM y la enfermedad cardiovascular.
Para explorar si las NPM son detectables dentro de la placa aterosclerótica y si la carga de NPM se asocia con la enfermedad cardiovascular, evaluamos la presencia de estas sustancias en placas de la arteria carótida extirpadas quirúrgicamente mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas por pirólisis, análisis de isótopos estables y microscopía electrónica. Posteriormente, determinamos si la presencia de NPM se asociaba con un criterio de valoración compuesto de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o muerte por cualquier causa.

MÉTODOS

Diseño del estudio
Realizamos un estudio prospectivo, multicéntrico y observacional en el que los pacientes fueron asignados a dos grupos (un grupo con placa en la que se detectaron micronúcleos y otro grupo con placa en la que no se detectaron micronúcleos) tras su inclusión en el estudio.
Los pacientes fueron reclutados en el Hospital Cardarelli, el Ospedale del Mare y la Universidad de Salerno entre el 1 de agosto de 2019 y el 31 de julio de 2020. Se seleccionaron para este estudio pacientes consecutivos con estenosis asintomática de la arteria carótida (según la clasificación del Ensayo Norteamericano de Endarterectomía Carotídea Sintomática¹⁴) para quienes estaba indicada la intervención. Se contactó a un total de 447 pacientes consecutivos para participar, y 312 aceptaron someterse a la selección. Se seleccionaron pacientes con enfermedad asintomática para participar en el estudio, con el fin de maximizar las probabilidades de supervivencia tras el procedimiento y minimizar la variabilidad interindividual en los fenotipos de placa.15,16 Se realizaron exámenes clínicos basales y se evaluaron las historias clínicas electrónicas para recopilar datos demográficos, clínicos y de intervención terapéutica. Se obtuvieron muestras de sangre siguiendo los procedimientos estándar tras un ayuno nocturno para el análisis de variables bioquímicas. Tras someterse a una endarterectomía carotídea, se realizó un seguimiento de los pacientes para monitorizar la incidencia de infarto de miocardio no mortal, accidente cerebrovascular no mortal y muerte por cualquier causa hasta el 1 de julio de 2023. Las visitas de seguimiento se realizaron según la práctica clínica habitual y no se programaron. Los participantes que no acudieron a las visitas durante el periodo de seguimiento se consideraron perdidos. Los eventos se determinaron mediante la revisión de las historias clínicas electrónicas por investigadores que desconocían los resultados de la cromatografía de gases-espectrometría de masas por pirólisis (y, por lo tanto, la asignación a los grupos).
El protocolo fue aprobado por el comité de ética local (Università Vanvitelli Caserta). Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito y nos adherimos a la lista de verificación de las directrices STROBE (Fortalecimiento de la Notificación de Estudios Observacionales en Epidemiología) para la presentación de datos.17 Las muestras de placa ateromatosa extirpadas quirúrgicamente de la región de bifurcación de la arteria carótida durante la aterectomía se recolectaron en tubos de vidrio y posteriormente se congelaron en nitrógeno líquido, se fijaron en formalina tamponada al 10 % o en glutaraldehído al 2,5 % de grado para microscopía electrónica para análisis posteriores. La abundancia de 11 nanopartículas magnéticas (NPM) diferentes se midió mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas por pirólisis (una técnica cuantitativa que mide las NPM en combinación y no distingue entre microplásticos y nanoplásticos), y los resultados se corroboraron mediante microscopía electrónica y análisis de isótopos estables. Las muestras se analizaron a medida que estuvieron disponibles para los investigadores, quienes desconocían los datos de resultados. Todos los autores acordaron enviar el manuscrito para su publicación.

Pacientes
Los pacientes eran elegibles si tenían entre 18 y 75 años, presentaban estenosis asintomática extracraneal de alto grado (>70%) de la arteria carótida interna y estaban programados para someterse a una endarterectomía carotídea. Los criterios de exclusión fueron evidencia de insuficiencia cardíaca, defectos valvulares, neoplasias malignas o causas secundarias de hipertensión. Se excluyeron del análisis los pacientes con complicaciones en el período postoperatorio antes del alta, con datos incompletos o que se perdieron durante el seguimiento.

Criterios de valoración
El criterio de valoración principal fue un compuesto de infarto de miocardio no mortal, accidente cerebrovascular no mortal o muerte por cualquier causa entre pacientes con placa que contenía nanopartículas magnéticas y pacientes con placa que no contenía dichas sustancias. Los criterios de valoración secundarios incluyeron los niveles de biomarcadores tisulares interleucina-18, interleucina-1β, factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interleucina-6, CD68, CD3 y colágeno en pacientes con evidencia de MNP en comparación con aquellos sin MNP.

Análisis estadístico
No se disponía de datos previos para determinar el tamaño de la muestra. Por lo tanto, se realizó un análisis intermedio con los primeros 100 pacientes para calcular dicho tamaño. Se observó que 61 pacientes presentaban evidencia de MNP en la placa y que estos pacientes tenían un riesgo 2,1 veces mayor de sufrir un evento del criterio de valoración principal que los pacientes sin MNP. Considerando un alfa de 0,05, un beta de 0,2, una tasa de eventos basal de 9 eventos por cada 100 personas-año en el grupo sin evidencia de MNP y un seguimiento planificado de 3 años, calculamos un tamaño muestral de 246 pacientes, con la intención de utilizar un modelo de riesgos proporcionales en el análisis de datos. Anticipamos una pérdida de seguimiento del 20% y ajustamos el tamaño muestral a 300 pacientes.
Tras el análisis de la placa aterosclerótica, los pacientes se asignaron a uno de dos grupos: pacientes con evidencia de MNP (con niveles detectables de al menos una de las dos sustancias) o pacientes sin evidencia de MNP. La distribución de las variables se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las variables continuas se compararon entre los dos grupos con una prueba t para datos con distribución normal, la prueba U de Mann-Whitney para datos con distribución no normal y la prueba exacta de Fisher para variables categóricas. Se realizaron análisis de regresión lineal para estimar la asociación entre la carga de MNP y los marcadores de placa. Se utilizó el análisis de regresión de Cox para examinar la asociación entre la presencia de MNP en la placa y la incidencia del criterio de valoración primario compuesto, ajustado por edad, sexo, índice de masa corporal, colesterol total, colesterol HDL y LDL, triglicéridos, creatinina, diabetes, hipertensión y eventos cardiovasculares previos. Se consideró un valor de p bilateral inferior a 0,05 como estadísticamente significativo. Todos los cálculos se realizaron con el software SPSS, versión 12. Las figuras se elaboraron con GraphPad Prism, versión 9.1.2.

RESULTADOS

Población de estudio y carga de plásticos
Se evaluó a un total de 312 pacientes sometidos a endarterectomía carotídea. De los pacientes evaluados, 8 sufrieron un accidente cerebrovascular o fallecieron antes del alta hospitalaria, y 47 presentaron datos incompletos o se perdieron durante el seguimiento.
De los 257 pacientes que completaron un seguimiento promedio (±DE) de 33,7±6,9 meses, 150 pacientes (58,4%) presentaron una cantidad detectable de polietileno en la placa carotídea extirpada, y 31 de ellos (12,1%) también presentaron una cantidad medible de cloruro de polivinilo en la placa carotídea.
Entre los pacientes con evidencia de estas nanopartículas metálicas en la placa, el nivel promedio de polietileno fue de 21,7±24,5 μg por miligramo de placa, y el nivel promedio de cloruro de polivinilo fue de 5,2±2,4 μg por miligramo de placa.
Nanopartículas metálicas en la placa de la arteria carótida. Los pacientes con evidencia de MNP eran más jóvenes; con mayor probabilidad de ser hombres; con menor probabilidad de padecer hipertensión; con mayor probabilidad de padecer diabetes, enfermedad cardiovascular y dislipidemia; con mayor probabilidad de fumar; y presentaban valores de creatinina más elevados que aquellos sin evidencia de plástico en la placa extirpada; las demás variables clínicas parecían similares en ambos grupos.
No se observaron diferencias aparentes en la incidencia de MNP según las áreas geográficas de residencia de los pacientes ni los centros donde fueron reclutados. No se encontraron diferencias sustanciales entre los pacientes incluidos en el análisis y los excluidos con respecto a las características clínicas de los pacientes ni a la prevalencia y los niveles de MNP detectados.

Características de los pacientes al inicio del estudio. Microscopía electrónica y análisis con isótopos estables
Para corroborar los resultados obtenidos mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas por pirólisis y obtener información preliminar sobre el tamaño de las nanopartículas magnéticas (NPM), evaluamos muestras de placa positivas para polietileno y cloruro de polivinilo de 10 pacientes seleccionados aleatoriamente mediante microscopía electrónica de transmisión y microscopía electrónica de barrido. La visualización con microscopía electrónica de transmisión reveló la presencia de partículas con bordes irregulares, probablemente de origen extraño, dentro de los macrófagos espumosos presentes en la placa ateromatosa y en el material amorfo de la misma. Estas partículas eran casi todas menores de 1 μm y probablemente de tamaño nanométrico.

Análisis de placa ateromatosa mediante microscopía electrónica.
Observando las mismas secciones mediante electrones retrodispersados ​​con microscopía electrónica de barrido, generamos mapas espectrales de rayos X de algunas partículas que se asemejaban a las observadas con microscopía electrónica de transmisión en cuanto a tamaño y forma. Estos mapas evidenciaron una reducción en la presencia de carbono y oxígeno en las muestras de placa y una mayor presencia de cloro. Para comparar los elementos detectables en las partículas con los presentes en el fondo, obtuvimos espectros de rayos X de dos áreas idénticas y confirmamos que la concentración de cloro era mayor dentro de las partículas. Como control adicional, también comparamos el contenido de cloro en dos áreas adyacentes idénticas, libres de partículas, y encontramos niveles similares. Dada la probable naturaleza no biológica del cloro en estado sólido, estos resultados podrían confirmar la presencia de depósitos de cloruro de polivinilo. Las muestras de 4 de los 10 pacientes analizados presentaron niveles de cloro detectables con este patrón. Se realizó un análisis de isótopos estables en 26 muestras aleatorias de placas de pacientes porque los plásticos derivados del petróleo tienen valores de δ13C más bajos (la relación entre el carbono-13 y el carbono-12) que los tejidos humanos.18 Este análisis identificó dos grupos distintos de pacientes: un grupo con valores isotópicos de δ13C más altos y otro con valores más bajos, lo que indicó relaciones más altas y más bajas, respectivamente, de carbono-13 a carbono-12. Los valores isotópicos más bajos de δ13C podrían deberse a la contaminación con MNP, ya que el material derivado del petróleo tiene una señal isotópica más baja que la de los tejidos humanos. Los valores isotópicos más bajos de δ¹³C fueron más evidentes en las placas con presencia de nanopartículas magnéticas (NPM).

Fenotipo de la placa
Dado que datos previos sugieren que las NPM pueden inducir vías proinflamatorias,¹³ se midieron cuatro marcadores inflamatorios —interleucina-18, interleucina-1β, interleucina-6 y TNF-α— mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). El contenido de colágeno de las muestras de placa y los niveles de CD3 y CD68, dos marcadores de infiltración de linfocitos y macrófagos, respectivamente, se evaluaron mediante inmunohistoquímica.
El análisis de regresión lineal reveló una correlación entre la cantidad de polietileno presente y los niveles de expresión de estos marcadores.

Marcadores inflamatorios en muestras de placa. Eventos cardiovasculares.
Se produjo un evento de criterio de valoración principal (infarto de miocardio no mortal, accidente cerebrovascular no mortal o muerte por cualquier causa) en 8 de 107 pacientes (7,5 %) del grupo sin evidencia de MNP (2,2 eventos por cada 100 pacientes-año) y en 30 de 150 pacientes (20,0 %) del grupo con evidencia de MNP (6,1 eventos por cada 100 pacientes-año) a los 33,7 ± 6,9 meses.
Los pacientes con MNP en la placa tuvieron un mayor riesgo de presentar un evento de criterio de valoración principal que los pacientes sin evidencia de MNP (cociente de riesgos instantáneos: 4,53; intervalo de confianza del 95 % [IC]: 2,00 a 10,27; p < 0,001), según lo demostrado por el análisis de regresión de Cox ajustado por factores de riesgo de enfermedad cardiovascular. El cociente de riesgos instantáneos no ajustado fue de 2,84 (IC del 95 %, 1,50 a 5,40; p = 0,007). Al analizar los niveles de MNP como variable continua, los resultados mostraron una asociación con el criterio de valoración principal.

DISCUSIÓN

Asociaciones entre la presencia de MNP y eventos cardiovasculares.
Entre los pacientes con estenosis carotídea asintomática de alto grado (>70 %) sometidos a endarterectomía carotídea, aquellos con evidencia de MNP en la placa carotídea presentaron una mayor incidencia de un evento compuesto de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o muerte por cualquier causa, en comparación con los pacientes sin evidencia de MNP en el ateroma. Los datos observacionales de estudios de exposición ocupacional sugieren un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular entre las personas expuestas a la contaminación por plásticos, incluido el cloruro de polivinilo, en comparación con la población general.19-21 Los datos mecanicistas de modelos preclínicos han propuesto tanto la translocación directa de nanopartículas magnéticas (NPM) a la circulación como mecanismos indirectos como posibles fundamentos de los efectos tóxicos cardiovasculares observados con las NPM, tal como se ha observado con otras nanopartículas, como las nanopartículas de oro inhaladas de tamaño similar a las NPM.22 Diversos estudios en ratones y ratas mostraron una amplia distribución de NPM tras la inhalación e ingestión, con acumulaciones consistentes en órganos altamente vascularizados y el corazón.23,24 El tamaño de las partículas influye en la capacidad de las NPM para alcanzar múltiples tejidos. Según una declaración de la Organización Mundial de la Salud, las nanopartículas magnéticas (MNP) de más de 150 μm o 10 μm de diámetro, respectivamente, no se absorben en la sangre ni penetran en los vasos sanguíneos.25 Nuestros hallazgos sugieren que los nanoplásticos, en lugar de los microplásticos, podrían acumularse en los sitios de aterosclerosis. De hecho, la gran mayoría de las partículas detectadas en el presente estudio también se encontraban por debajo del umbral de 200 nm sugerido para el intestino y otras barreras, y eran visibles en el espacio extracelular como restos dispersos, lo que concuerda con la idea de que la absorción y distribución de las nanopartículas magnéticas (NPM) aumentan a medida que disminuye su tamaño.26
Datos de estudios en humanos han demostrado que se han detectado NPM de hasta 30 μm en muestras de hígado, hasta 10 μm en muestras de placenta, hasta 88 μm en muestras de pulmón, hasta 12 a 15 μm en leche materna y orina, y más de 700 nm en sangre total.7-12 Cualitativamente, el análisis de pirólisis-cromatografía de gases-espectrometría de masas indicó que, entre las 11 NPM analizadas, el polietileno y el cloruro de polivinilo eran detectables en la placa carotídea en cantidades de microgramos (μg por miligramo de placa). Estudios previos que utilizaron la misma tecnología demostraron que el polietileno se encontraba en aproximadamente el 25 % de las muestras de sangre total de voluntarios sanos, con una concentración máxima de 7,1 μg por mililitro.12 Otros estudios han sugerido que el polietileno y el cloruro de polivinilo también fueron las nanopartículas magnéticas más abundantes encontradas en la leche materna y la orina humanas,10,11 observándose fibras de polietileno en el tejido pulmonar humano a una concentración de 1 partícula por gramo de tejido.8 La presencia de cloruro de polivinilo también se ha demostrado en un número constante de muestras de hígado obtenidas de pacientes con cirrosis, en el rango de unas pocas partículas por gramo de tejido.9. Se ha informado que los nanoplásticos de polietileno inducen una serie de efectos nocivos en el sistema cardiovascular de embriones de pez cebra, promoviendo el desarrollo de derrames pericárdicos, la inhibición de la angiogénesis y la inducción de un estado protrombótico.27 Datos similares están disponibles en estudios sobre los efectos del cloruro de polivinilo.28 Sin embargo, en la mayoría de los estudios preclínicos, se han encontrado altos niveles de Se evalúan MNP —órdenes de magnitud superiores a los observados en el presente estudio—, un factor que dificulta la extrapolación de la relevancia de los hallazgos preclínicos a los humanos.
El polietileno y el cloruro de polivinilo, en sus diversas formas, se utilizan en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la producción de envases para alimentos y cosméticos, así como tuberías de agua. Se han encontrado nanopartículas metálicas (NPM) en el agua potable, una gran variedad de alimentos, productos cosméticos y aire, también en forma de partículas finas inhalables con un diámetro aerodinámico de 2,5 μm o menos (PM2,5), transportadas a largas distancias por el viento.5,6,29,30 Dada la amplia distribución y disponibilidad de las NPM, la atribución de todas las posibles fuentes en humanos es prácticamente imposible. Nuestro estudio no se diseñó específicamente para explorar las posibles fuentes de plásticos subyacentes a la presencia de NPM en la placa carotídea.
La comparación de datos según la ubicación de los domicilios de los pacientes y de los centros de reclutamiento no reveló diferencias evidentes.
No podemos determinar por qué solo se detectaron polietileno y cloruro de polivinilo, entre los 11 tipos de plásticos evaluados. Estudios en modelos animales sugieren que las características fisicoquímicas de las diferentes nanopartículas magnéticas (NPM) influyen en su alcance a órganos distantes.30,31
Se requiere investigación adicional para determinar si el polietileno y el cloruro de polivinilo se acumulan preferentemente en la placa y si son más patógenos que otros tipos de NPM en este sentido.
Es importante señalar que nuestros resultados no demuestran causalidad. La asociación entre la presencia de NPM en la placa y la incidencia de un resultado compuesto de enfermedad cardiovascular o muerte también puede implicar el riesgo derivado de la exposición a otras variables de confusión residuales no medidas, como exposiciones desconocidas durante la vida del paciente o, de forma más general, el estado de salud y los comportamientos de los pacientes. Además, no consideramos los niveles de exposición a PM2.5 y PM10, un factor de riesgo emergente para la enfermedad cardiovascular.31

Nuestro estudio presenta limitaciones.
A pesar de las medidas preventivas adoptadas, no se puede descartar por completo la contaminación del laboratorio. Aunque aplicamos procedimientos actualizados para la recolección y el análisis de muestras de placa, podría existir un riesgo residual de contaminación. Futuros estudios realizados en salas blancas, donde no se utiliza plástico de ningún tipo salvo el material en estudio, podrían corroborar nuestras observaciones.
No disponíamos de datos socioeconómicos para nuestra población de estudio. Los ingresos y la educación, entre otras condiciones, están relacionados con una amplia gama de resultados y podrían ser particularmente relevantes.32
Nuestros hallazgos se refieren únicamente a una población de pacientes asintomáticos sometidos a endarterectomía carotídea, que puede no ser representativa de la población general.14 Por lo tanto, nuestros hallazgos podrían no ser generalizables. No exploramos las variables de alimentación y agua potable, que podrían estar relacionadas con la acumulación de nanopartículas magnéticas (NPM) en humanos.25,33,34 Por lo tanto, es posible que el supuesto papel de las NPM en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares sea limitado en comparación con los factores de riesgo convencionales, dado que durante décadas la exposición a los plásticos presumiblemente ha aumentado, la tasa de enfermedades cardiovasculares ha disminuido.35 Sin embargo, los resultados de nuestro estudio muestran que los pacientes con NPM detectadas en la placa de la arteria carótida tienen un mayor riesgo de un desenlace compuesto de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o muerte por cualquier causa a los 34 meses de seguimiento.