LABORATORIO DE URGENCIAS

Científicos Descubren un Gen de la Longevidad

El gen OSER1, regulado por FOXO, reduce el estrés oxidativo y prolonga la vida en diversas especies.

                                                                Jiangbo Song, Zhiguan Li, Lei Zhou, Xin Chen; Wei Qi, Guinevere Sew,
                                                                Hector Herranz, Zilu Ye, Jesper Velgaard Olsen, Yuan Ki, Marianne Nygaard,
                                                                Kaare Christensen, Vilhelm A. Bohr, Lene Rasmussen and Fangyin Dai

                                                                                  Nature Communications (Sept 2024) volume 15, Article number: 7144

Investigaciones sobre las bases moleculares del envejecimiento sugieren que la familia de factores de transcripción FOXO es un regulador crítico de los genes que modulan el envejecimiento, la esperanza de vida y la respuesta al estrés oxidativo. Las proteínas FOXO modulan las vías de señalización posteriores a la insulina/factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1), AMPK, TOR, JNK y la restricción dietética (RD), e integran las señales de estas vías. Los genes y las vías reguladas por FOXO están ampliamente implicados en enfermedades relacionadas con la edad, como el cáncer⁹, la enfermedad de Alzheimer y la diabetes mellitus tipo 2.
El estrés oxidativo elevado se asocia con el cáncer, la enfermedad renal crónica y la neurodegeneración. Las proteínas FOXO regulan y son reguladas por el nivel redox y el estrés oxidativo¹⁶. Por ejemplo, las proteínas FOXO regulan positivamente la catalasa (CAT), la superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD) y las sestrina, al tiempo que suprimen la expresión de genes mitocondriales y regulan la respuesta al daño oxidativo del ADN.
Se han identificado y caracterizado genes diana de FOXO en Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila melanogaster (D. melanogaster), ratón y células humanas, o mediante metaanálisis y estudios ómicos comparativos multiespecie. Sin embargo, muchos genes regulados por FOXO y sus funciones biológicas siguen estando poco caracterizados. Mientras tanto, un sistema experimental emergente como el gusano de seda (Bombyx mori, B. mori) podría revelar la identidad de genes conservados que promueven la longevidad y que no se pueden identificar fácilmente en los sistemas modelo experimentales más utilizados, como levaduras, gusanos, moscas y ratones. En este trabajo, identificamos y caracterizamos una diana de FOXO, la proteína 1 rica en serina sensible al estrés oxidativo (OSER1), cuya sobreexpresión o subexpresión aumenta o disminuye la esperanza de vida, respectivamente, en B. mori, C. elegans y D. melanogaster. La posible influencia de OSER1 en la esperanza de vida humana está respaldada por estudios en sujetos humanos.

RESULTADOS

Análisis transcriptómico de los genes diana de FOXO
El análisis comparativo de los genes FOXO entre B. mori y C. elegans, D. melanogaster y Homo sapiens reveló características estructurales altamente conservadas, como un dominio de unión al ADN tipo horquilla (FHD), señales de localización nuclear (NLS) y un dominio de transactivación (TAD), así como sus estructuras terciarias, lo que sugiere la posibilidad de utilizar el gusano de seda para la detección de genes diana de FOXO. Para analizar los genes diana transcripcionales de FOXO en gusanos de seda, se construyeron plásmidos que contenían BmFoxO de tipo silvestre o siRNA dirigido a BmFoxO y se transfectaron en células BmN-SWU1 de gusano de seda, en las que BmFoxO se reguló positiva o negativamente, respectivamente, como se esperaba. Sin embargo, el BmFoxO de tipo silvestre se sobreexpresó predominantemente en las células BmN-SWU1 como una forma fosforilada citosólica inactiva. Para resolver este problema, se transfectó un mutante de BmFoxO constitutivamente activo (BmFoxOCA) y se sobreexpresó en células BmN-SWU1. El mutante BmFoxOCA carece de sitios de fosforilación de AKT y se expresa principalmente en el núcleo de las células BmN-SWU1. Posteriormente, identificamos 3185 transcritos regulados al alza y 467 regulados a la baja en células que sobreexpresaban BmFoxOCA, mientras que 3876 transcritos fueron regulados al alza y 271 regulados a la baja en células con deficiencia de BmFoxO de todo el transcriptoma que abarca 14 623 genes. Identificamos 69 genes que fueron regulados al alza por la sobreexpresión de BmFoxO y regulados a la baja por la inhibición de BmFoxO (es decir, objetivos positivos), y 111 genes que fueron regulados a la baja por la sobreexpresión de BmFoxO y regulados al alza en células con inhibición (es decir, objetivos negativos). El análisis de ontología génica (GO) reveló que estos genes participan en diversas funciones celulares, y el análisis KEGG sugirió su papel en el metabolismo, el procesamiento de información genética y ambiental, y múltiples procesos orgánicos y celulares. Varios genes se vincularon con enfermedades humanas.
Investigaciones posteriores indicaron su participación en el ciclo de Krebs, el procesamiento de proteínas y la vía de señalización PI3K-Akt. Los análisis bioinformáticos mostraron que el 30,94 % de los genes humanos tienen genes ortólogos en los gusanos de seda, mientras que los genes de nematodos y Drosophila tienen ortólogos humanos conocidos (que representan el 26,94 % y el 32,20 % del genoma humano, respectivamente). Curiosamente, de los 180 objetivos principales de BmFoxO identificados en el análisis transcriptómico, 18 están conservados y 162 son específicos de los gusanos de seda o aún no se han descrito en otras especies.

OSER1 prolonga la vida útil en múltiples especies.
Para confirmar la regulación directa de los genes diana putativos por BmFoxO, se buscó el motivo de unión consenso de FOXO en una secuencia de ADN genómico de 3 kb en la región promotora corriente arriba de los genes diana candidatos de BmFoxO, revelando posibles coincidencias en 42 de 180 genes diana putativos. Veinticuatro de estos genes tienen ortólogos en C. elegans que no se habían reportado previamente como dianas de daf-16, y nueve de los otros 18 genes tienen ortólogos en humanos y ratones. Para investigar las funciones biológicas de estos genes putativos regulados por FOXO, se realizó la inactivación génica mediante siRNA en C. elegans y se midió la vida útil de las cepas con inactivación génica y las cepas control. Los resultados muestran que la inactivación de 7 genes acortó la esperanza de vida (jmjd-5, F02E9.5, B0303.3, eat-3, aco-2, fkh-10, rabx-5), mientras que la inactivación de 3 genes (znf-782, pygl-1, C24A1.3a) la aumentó.
La inactivación de F02E9.5 (ortólogo en C. elegans del gen BGIBMGA002356 del gusano de seda) tuvo el mayor impacto entre todos los posibles genes diana de FOXO, provocando una disminución de la esperanza de vida del 17 %. Tras identificar el gen BGIBMGA002356, regulado positivamente por BmFoxO, y su ortólogo en C. elegans, como posible gen conservado de longevidad, buscamos genes ortólogos en otras especies. El análisis filogenético reveló que este gen se conserva desde C. elegans hasta los humanos, con genes homólogos que forman cuatro grupos (es decir, nematodos, insectos, anfibios y peces, mamíferos), todos los cuales comparten un dominio proteico de función desconocida (DUF776).
Dado que el homólogo humano se identificó previamente como Proteína 1 rica en serina inducida por oxidación (OSER1), adoptamos la siguiente nomenclatura: B. mori BGIBMGA002356, BmOSER1; C. elegans F02E9.5, Ceoser1; D. melanogaster CG5056, DmOser1. Análisis adicionales mostraron que la disminución o la sobreexpresión de Ceoser1 en nematodos N2 de tipo silvestre disminuye o aumenta la esperanza de vida, respectivamente. De manera similar, la inactivación de BmOSER1 mediante CRISPR-Cas9 acortó la esperanza de vida del gusano de seda, lo cual concuerda con el efecto de la reducción de BmOSER1, mientras que la sobreexpresión de BmOSER1 la aumentó. Además, en condiciones que promueven una expresión baja o alta de DmOser1, la esperanza de vida promedio de las moscas fue correspondientemente más corta o más larga, respectivamente. Observamos que la esperanza de vida general se prolonga cuando DmOser1 se sobreexpresa levemente en hembras, pero la esperanza de vida máxima se prolongó tanto en moscas macho como hembra.
Por el contrario, la esperanza de vida se prolongó en ambos sexos cuando DmOser1 se sobreexpresó en gran medida. Estos datos demuestran que OSER1 es un regulador conservado de la longevidad en nematodos, gusanos de seda y moscas.

OSER1 es un objetivo de FOXO.
Como se mencionó anteriormente, la secuencia 3 kb aguas arriba del codón de inicio de BmOSER1 incluye posibles sitios de unión de BmFoxO. Para explorar si la proteína BmFoxO se une a estas secuencias in vitro, se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) utilizando proteína BmFoxO purificada y un fragmento de ADN BmOSER1 marcado con biotina, en ausencia o presencia de un exceso de ADN competidor sin marcar. Los resultados demuestran la unión específica de la proteína BmFoxO al promotor de BmOSER1. Para evaluar las consecuencias funcionales de esta interacción, la supuesta región promotora de BmOSER1 (desde 1 kb aguas arriba del ORF de BmOSER1 hasta el codón de inicio) se clonó aguas arriba del gen reportero de luciferasa en el vector pGL3 y se utilizó en un ensayo de luciferasa dual con o sin coexpresión de BmFoxOCA.
Los resultados muestran que la expresión de BmOSER1 se induce drásticamente en células de B. mori que sobreexpresan BmFoxOCA. Se observaron resultados similares cuando se realizó el mismo experimento en células Sf9 de Spodoptera frugiperda.
La microscopía confocal mostró que BmOSER1 se localiza principalmente en el núcleo celular, lo cual también se observó en células U2OS humanas.
Los estudios espaciotemporales demostraron que BmOSER1 se expresa en múltiples etapas del desarrollo (con un pico en L5D1 y en la etapa de migración) y en diversos tejidos (con alta expresión en órganos reproductores como ovarios y testículos), y que su expresión aumenta con la edad. Para comprender con mayor detalle la regulación de OSER1 por FOXO, sobreexpresamos FOXO1, FOXO3, FOXO4 y FOXO6 en células U2OS humanas tras un análisis bioinformático que predijo la presencia de motivos de unión a FOXO en la región promotora de OSER1. En condiciones basales, los genes diana directos de FOXO, como la catalasa (CAT) y la superóxido dismutasa 2 (SOD2), se expresan a un nivel muy bajo. Sin embargo, la exposición a peróxido de hidrógeno aumentó la expresión del ARNm de SOD1 y OSER1. Estos datos demuestran que OSER1 es un objetivo de FOXO, se expresa en el núcleo y se induce por estrés oxidativo.

OSER1 regula la respuesta al estrés oxidativo.
Para investigar si OSER1 participa en la respuesta al estrés oxidativo, se midió el porcentaje de supervivencia en moscas mutantes DmOser1, moscas con sobreexpresión de DmOser1 (OE) y moscas control expuestas a 20 mM de paraquat. Los resultados muestran un menor porcentaje de supervivencia en presencia de estrés oxidativo en las moscas mutantes DmOser1 y un mayor porcentaje de supervivencia en las moscas DmOser1-OE que en las moscas control. En consonancia con esto, la tinción con dihidroetidio (DHE) para cuantificar la abundancia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los discos imaginales de las alas sugirió niveles más bajos de ROS/estrés oxidativo en las moscas DmOser1-OE que en las moscas control, debido principalmente a una menor abundancia de ROS en las regiones de la bisagra y la bolsa alar del disco alar. Además, las moscas DmOser1-OE expresaron niveles más bajos de ARNm del gen antioxidante Sod2 que las moscas control. Esto se alinea con los roles típicos de SOD2, cuya expresión se desencadena por el estrés oxidativo. Los sobreexpresores de SOD2 son más resistentes, y sus depleciones son más vulnerables al estrés oxidativo en Drosophila. Las moscas hembra DmOser1-OE fueron más resistentes a la inanición, mientras que las moscas macho y hembra DmOser1-OE fueron más resistentes al choque térmico que las moscas de control. Las larvas de gusano de seda con deleción de BmOSER1 fueron más sensibles al choque térmico que los controles y los gusanos de seda machos adultos regularon positivamente BmOSER1 y BmSOD1 después del choque térmico. Cuando los gusanos de seda adultos fueron dosificados con 50 mM de peróxido de hidrógeno por inyección, la transcripción de BmCAT y BmOSER1 aumentó significativamente y la transcripción de BmOSER1, BmSOD1, BmCAT y glutatión peroxidasa 1 (BmGpx) aumentó en la línea celular BmE tratada con peróxido de hidrógeno. Cuando se sobreexpresó BmOSER1 en células BmE tratadas con peróxido de hidrógeno, la abundancia de especies reactivas de oxígeno (ROS) disminuyó y la expresión de BmSOD1 y BmCAT se redujo.
Estos resultados indican que la expresión de OSER1 regula y es regulada por condiciones ambientales, incluido el estrés oxidativo.
También se exploró el papel de OSER1 en la respuesta y mitigación del estrés oxidativo en nematodos con silenciamiento de Ceoser1. Es importante destacar que los nematodos con silenciamiento de Ceoser1 tuvieron una vida útil más corta que los nematodos control, pero la N-acetilcisteína (NAC) normalizó (prolongó) específicamente su vida útil, mientras que los experimentos de control mostraron que la NAC no prolonga la vida útil de los nematodos control.
Curiosamente, la sobreexpresión de Ceoser1 aumentó la vida útil de los nematodos con altos niveles de ROS después del tratamiento con 4 mM de TBHP. Dado que la regulación de la longevidad por Ceoser1 está relacionada con el estrés oxidativo, detectamos los niveles celulares de ROS mediante tinción con DCF tras la inactivación de Ceoser1 y observamos que la disminución de Ceoser1 incrementaba la fluorescencia de DCF. Esto también se confirma al observar niveles elevados de peróxido de hidrógeno en gusanos con expresión de HyPer tras la inactivación de Ceoser1.
Además, cuando se redujo la expresión de Ceoser1 en nematodos que portaban una etiqueta GFP inducible por estrés oxidativo integrada, la fluorescencia de GFP aumentó a un nivel que se elevó aún más tras un choque térmico.
Los resultados sugieren que OSER1 mejora la resiliencia y la resistencia al estrés oxidativo, lo que podría contribuir directamente a la prolongación de la vida útil.
Los análisis transcriptómicos en gusanos de seda con sobreexpresión de BmOSER1 y nematodos con deficiencia de Ceoser1 revelaron la posible implicación de OSER1 en la biogénesis mitocondrial y otras funciones mitocondriales. Esto se exploró mediante la reducción de la expresión de Ceoser1 en nematodos [myo-3p::TOM20::RFP(mit)] y SJ4103 [myo-3::GFP(mit)] con mitocondrias marcadas fluorescentemente. Curiosamente, las mitocondrias fragmentadas fueron más abundantes en los nematodos con reducción de la expresión de Ceoser1 que en los nematodos control, y la concentración de ATP intracelular disminuyó significativamente.
Estudios previos demostraron que, en la vía de señalización DAF-2/insulina, los mutantes daf-2/InR (receptor de insulina) tienen una longevidad superior al 100%; los mutantes age-1/PI3K, un 40% mayor; y los mutantes daf-16/FOXO, un 12% menor en C. elegans. En este estudio, mostramos que la expresión de Ceoser1 es menor en los mutantes daf-16/FOXO y mayor en los mutantes daf-2/InR.
En el mutante eat-2, que imita la restricción dietética, la expresión de Ceoser1 aumenta. Además, en los nematodos skn-1/NRF2 con ganancia de función, que presentan una mayor desintoxicación, biogénesis mitocondrial y una mayor longevidad, la expresión de Ceoser1 se encuentra regulada al alza. Sin embargo, la expresión de Ceoser1 no se modificó en los animales control ni en los mutantes pmk-1/p38 y glp-1/NOTCH.
A diferencia de otros objetivos principales conocidos de DAF-16, la reducción de la expresión de Ceoser1 en nematodos mutantes daf-2 solo acortó la esperanza de vida en aproximadamente un 10 %.
Concluimos que Ceoser1 se sobreexpresa en los mutantes daf-2 y eat-2, que promueven la longevidad, y en el mutante skn-1 con ganancia de función, y se subexpresa en los mutantes daf-16, que reducen la longevidad. Esto indica que OSER1 actúa después del nodo convergente FOXO.

OSER1 promueve la reproducción.
Se examinaron las funciones biológicas de OSER1 humano en células U2OS con sobreexpresión o deficiencia de OSER1 mediante un sistema de expresión lentiviral. El análisis GO de los genes diferencialmente expresados ​​(DEGs) en células con deficiencia de OSER1 reveló enriquecimiento de genes implicados en la senescencia celular, el ciclo celular, el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), la senescencia inducida por estrés oxidativo y la reproducción, así como enriquecimiento sustancial de genes implicados en vías relacionadas con el ciclo celular en células OSER1-OE, lo cual concuerda con la localización nuclear de OSER1 en gusanos de seda y células U2OS.
Se confirmó un posible papel de OSER1 en la reproducción al demostrar que la sobreexpresión de BmOSER1 aumentaba la fertilidad de los huevos y potenciaba la actividad de apareamiento de los gusanos de seda machos, lo que resultaba en apareamientos más exitosos. Curiosamente, la deficiencia de BmOSER1 disminuyó la puesta de huevos. En C. elegans, el número de descendientes no se vio afectado por la reducción de Ceoser1, pero aumentó en nematodos Ceoser1-OE.

OSER1 se asocia con la longevidad en humanos.
Finalmente, investigamos las variantes genéticas de OSER1 en humanos. Un total de 49 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) comunes en OSER1, que representan siete grupos independientes (r² < 0,1) basados ​​en desequilibrio de ligamiento (LD), cumplieron con los criterios de calidad aplicados y se detectaron tanto en individuos mayores de 90 años como en controles más jóvenes.
La dosis del alelo menor de dos de los 49 SNP de un grupo independiente basado en LD se asoció significativamente (P < 0,0024) con la longevidad. Además, la dosis del alelo menor de cinco SNP de otro grupo basado en LD se asoció con la longevidad con un nivel de significación nominal (P < 0,05).
Ningún SNP mostró una asociación significativa con la edad de la menopausia en mujeres longevas o más jóvenes. Sin embargo, se encontraron varias asociaciones nominalmente significativas entre una mayor dosis del alelo menor y una mayor edad de la menopausia, especialmente en mujeres longevas. En resumen, los estudios realizados en seres humanos respaldan la idea de que OSER1 también influye en la esperanza de vida en los seres humanos.

DISCUSIÓN

El estrés oxidativo se considera un factor clave en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad. En respuesta al estrés oxidativo, las proteínas FOXO regulan positivamente los genes antioxidantes y suprimen los genes mitocondriales. En este estudio, se utilizaron modelos animales de envejecimiento, tanto emergentes como bien establecidos, para identificar y caracterizar la proteína de longevidad OSER1, un determinante de la longevidad altamente conservado y regulado por FOXO en gusanos de seda, moscas y nematodos. Los resultados presentados aquí muestran que la regulación positiva o negativa de OSER1 afecta la esperanza de vida de forma algo más significativa en gusanos de seda y moscas que en nematodos. Si bien aún se desconoce la base molecular de esta observación, postulamos que la(s) función(es) fisiológica(s) de los homólogos de OSER1 podrían diferir en estas diversas especies. Los datos transcriptómicos, seguidos de estudios in vivo, demuestran que OSER1 proporciona una fuerte protección contra el estrés oxidativo a nivel orgánico y celular, lo que sugiere que podría mitigar el estrés oxidativo aguas abajo de FOXO, de forma similar a SOD2, CAT y GPX1 en múltiples especies. En células humanas y de gusano de seda no sometidas a estrés, OSER1 se localiza en el núcleo, pero la red de proteínas citosólicas y nucleares que media sus efectos biológicos aún no se comprende completamente.
El estrés térmico aumenta la esperanza de vida de la levadura y C. elegans, lo que podría reflejar y depender de mayor expresión del factor de choque térmico (HSF-1).
HSF1 y FOXO cooperan para activar la expresión de pequeñas proteínas de choque térmico y así prolongar la vida. La disminución de la actividad de DAF-16/FOXO y HSF-1 se ha relacionado con una menor esperanza de vida en C. elegans con suplementación de glucosa.
El estrés térmico estimula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la expresión de MnSOD y BmOSER1.
Un estudio en pez cebra demostró una correlación entre el choque térmico y mayor expresión de OSER1 y ROMO1. Sin embargo, el mecanismo por el cual OSER1 confiere termotolerancia aún no está claro.
En resumen, el presente estudio aporta pruebas contundentes de que OSER1 aumenta la resiliencia y la resistencia al estrés oxidativo, al choque térmico y a otros tipos de estrés celular, al tiempo que provoca un aparente aumento de la esperanza de vida en diversas especies.
Finalmente, destacamos la necesidad de seguir investigando las funciones biológicas y el mecanismo de acción de la proteína de longevidad OSER1.